in vitro dei vegetali

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1 1! Introduzione alle colture in vitro dei vegetali Principali tappe nello sviluppo delle colture in vitro di vegetali Il laboratorio per le colture in vitro di vegetali: specificità ed attrezzature 2! Breve storia delle colture in vitro dei vegetali! 1838 Schleiden e Schwann, biologi tedeschi, introducono il concetto di totipotenza della cellula, ovvero la capacità di questa di formare un organismo completo pluricellulare 1902 Haberlandt (G) tenta, senza successo, di far crescere in vitro su mezzo nutritivo frammenti di vari tessuti di piante diverse 1922 Kotte (G) e Robbins (USA), indipendentemente, mettono a punto un protocollo per la moltiplicazione di meristemi radicali in un mezzo di coltura a composizione minerale, ma non ne ottengono la crescita illimitata

2 3! Breve storia delle colture in vitro dei vegetali! 1934 White (USA) ottiene l accrescimento in vitro per un tempo prolungato di porzioni di apici di radici di pomodoro e di altre Dicotiledoni in un mezzo minerale arricchito con estratti di lievito e saccarosio 1937 Went e Thimann scoprono il primo ormone vegetale, l acido indol-acetico (IAA) 1939 White (USA), Gautheret e Nobécourt (F), indipendentemente, dimostrano che per ottenere una crescita illimitata in vitro di tessuti non meristematici sia necessaria la presenza di una auxina (IAA) negli espianti (White) o nel mezzo di coltura (Gautheret e Nobécourt) 4! Breve storia delle colture in vitro dei vegetali! 1955 Morel (F) ottiene piante di Dalia e di Orchidea esenti da virus attraverso coltura in vitro di meristemi; mette a punto il protocollo per la massiva propagazione di Orchidacee da protocormi rigenerati in vitro Skoog (USA) dai prodotti di degradazione del DNA autoclavato isola la prima citochinina (kinetina o 6-benzil-amminopurina) e dimostra la sua funzione sulla promozione della divisione cellulare in colture di calli di tabacco 1957 Skoog e Miller (USA) dimostrano che ben precisi rapporti tra auxine e citochinine provocano il differenziamento in vitro di radici e germogli da colture di tessuti fogliari di tabacco 1958 Reinert e Steward (USA), indipendentemente, scoprono che è possibile ottenere embrioni somatici da coltura di singole cellule di carota

3 5! Breve storia delle colture in vitro dei vegetali! 1960 Jones (UK) dimostra la produzione di cloni da singola cellula (linea clonale) Cocking (UK) ottiene per la prima volta cellule vitali vegetali prive di parete (protoplasti) 1964 Guha e Maheshwari (USA) dimostrano la possibilità di ottenere piante aploidi o di-aploidi da colture in vitro di antere di Datura innoxia 1970 Nagata e Takebe (J) ottengono piante di tabacco da calli provenienti da colture di protoplasti 6! Coltura in vitro PROCESSO PER IL QUALE TESSUTI ED ORGANI VEGETALI SONO ISOLATI E COLTIVATI IN CONDIZIONI DI STERILITÀ SU SUBSTRATO ARTIFICIALE

4 7! Colture in vitro: preparazione dei substrati! 8! Colture in vitro: sterilizzazione dei substrati e dei ferri! Autoclave sterilizzazione per via umida 20 minuti, 120 C, MPa Stufa sterilizzazione a secco 3 ore, 160 C Controllo: 1. livello acqua (autoclave) 2. temperatura 3. effettiva sterilità dei mezzi/attrezzi

5 9! Colture in vitro: i vasi di coltura! 10! Colture in vitro: cappa a flusso laminare orizzontale! motore e pre-filtri lampada UV filtri 0,2 µm ripiano sterilizzabile

6 11! Camere di allevamento per piante e cellule in vitro! Controllo: 1. luce (qualità, quantità e disposizione delle lampade) 2. temperatura 3. umidità 12! Allevamento per piante e cellule in vitro. Luce (qualità), confronto spettri PAR light: luce utile per la fotosintesi

7 13! Allevamento per piante e cellule in vitro. Luce (qualità): spettro delle lampade e del Sole 14! Allevamento per piante e cellule in vitro: luce (quantità)

8 15! 16! Allevamento per piante e cellule in vitro: temperatura Colture in vitro: esempi di allevamento!

9 17! Esempio di laboratorio! Ingresso/ Uscita bancale per le colture bancale per le colture bancale per le colture cucina bancale per le colture Autoclave! Vestibolo Zona manipolazione cappa cappa