Ossigenatore: Necessario per ossigenare e mescolare l acqua che bagnerà le radici (il ristagno idrico induce il marciume radicale)

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1 Idroponica L idroponica è un sistema di coltura, inventato intorno agli anni 20 del novecento, che consiste nella crescita di specie vegetali fuori suolo, con l utilizzo di un substrato inerte (argilla espansa, perlite, vermiculite, lana di roccia, fibra di cocco e torba) e con un irrigazione arricchita di sostanze nutritive (macroelementi e microelementi).

2 Componenti Vasca di stoccaggio della sostanza nutritiva: È un semplice recipiente contenente la soluzione di fertilizzazione Ossigenatore: Necessario per ossigenare e mescolare l acqua che bagnerà le radici (il ristagno idrico induce il marciume radicale) Pompa acqua: Utilizzata per trasportare la soluzione alle radici nei sistemi di idroponica a goccia e a «canale inclinato»

3 Esempio L idroponica offre la capacità di effettuare un intero ciclo riproduttivo delle specie vegetali. Esempio impianto idroponico a goccia plantula Capsicum annuum germinata in torba con argilla espansa Piante dopo 40 giorni Fruttificazione dopo 70 giorni (brevidiurna)

4 Micropropagazione La micropropagazione è una tecnica che consente di propagare piante per via vegetativa, mediante la coltura in vitro di organi o cellule, ottenendo in tal modo dei cloni. Il concetto fondante è la totipotenza delle cellule vegetali, esse infatti sono in grado di differenziarsi e sdifferenziarsi grazie ai fitoregolatori contenuti nel substrato agarizzato. Attualmente i protocolli di micropropagazione più utilizzati per la produzione in scala industriale di piante constano di diverse operazioni: stabilizzazione dell espianto, moltiplicazione, allungamento, radicazione e ambientamento Fase di moltiplicazione Fase di radicazione Fase di allungamento Fase di ambientamento

5 Conclusioni La possibilità di utilizzare un supporto solido inerte, la capacità di assorbimento dei nutrienti da un substrato liquido e la consistente produttività delle tecniche di rigenerazione in vitro, apre la strada verso una connessione tra micropropagazione e idroponica. Spinti dagli innumerevoli vantaggi apportati dal substrato liquido come: Bassa resistenza al trasporto idrico. Assenza del gradiente di concentrazione dei nutrienti Abbassamento parziale dei costi per l assenza dell agar Si è cercato di conciliare l utilizzo delle due tecniche attraverso la costruzione di bioreattori che sostituiscono alcuni passaggi della micropropagazione, attuati sino ad ora su substrato agarizzato.

6 Sistema TIS (Temporary Immersion Sistem) Il TIS è un sistema di coltura dei germogli che sostituisce la fase di allungamento nel processo di micropropagazione. Grazie all utilizzo di una pompa ad aria il substrato liquido viene spinto fino a bagnare la parte basale del germoglio. Nella fase sperimentale è stato visto come il TIS sia più efficiente rispetto alle classiche tecniche di micropropagazione, esso infatti consente una maggior areazione del germoglio (poichè il liquido viene messo a contatto con la plantula ogni 12 ore) e un miglior assorbimento dei nutrienti e dei fitoregolatori. In questo modo siamo in grado di ridurre tempi e costi di lavorazione.

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8 Problematiche riferite ai bioreattori La sterilità dell intero complesso è una prerogativa essenziale nello sviluppo di una coltura in bioreattore, le cellule vegetali infatti, crescono più lentamente rispetto ai microorganismi che causano sottrazione dei nutrienti e secrezione di composti tossici. Il bilancio costi benefici deve essere studiato confrontando le spese necessarie per una coltura in agar e le spese per una coltura in bioreattore considerando i costi dell impianto. I bioreattori sono attualmente in grado di mantenere in coltura un solo organo vegetale e non più organi contemporaneamente (alcuni metaboliti estratti da specie vegetali hanno bisogno della contemporanea presenza di tutti gli organi). Per ogni processo di organogenesi è necessario un diverso «status» colturale

9 Alcune idee su bioreattori Pietro Costanzi

10 Componenti Arancione = Box di propagazione dove viene nebulizzato il substrato. Rosa = Filtro aria HEPA h14 per sterilizzare l aria in entrata. Celeste = Pompa ad aria con flusso regolabile. Nero = serbatoio di Propagazione che contiene il substrato da nebulizzare. Marrone = Valvola necessaria per l uscita del liquido dal tubo di caricamento, altrimenti ogni qual volta si aggiungesse substrato esso verrebbe diluito con il substrato già presente nel tubo.

11 Componenti Nero = Il barometro necessario per riconoscere la pressione di utilizzo dei nebulizzatori (strumento utile solo in fase di sperimentazione). Arancione = Pompa ad acqua per l immissione e nebulizzazione del substrato. Celeste = valvola di non ritorno per la fuoriuscita dell aria pompata nel reattore. Rosa = sistema sterilizzazione a T (vedi bioreattore 1).

12 Componenti Celeste = sono rappresentate le componenti di attacco e stacco. Questi moduli sono essenziali per permettere la separazione del box di propagazione dalle componenti basali del reattore (pompa aria, pompa acqua, filtro e serbatoio). Grazie a questa alternativa è possibile spostare l intero box all interno di una cappa a flusso laminare o di un ambiente sterile per un eventuale necessità di interventi manuali. Inoltre, ai fini della sperimentazione, questa caratteristica ammette all occorrenza la sostituzione della componente «box di propagazione» sperimentando un altro meccanismo di erogazione del substrato senza ricostruire per intero il reattore.

13 Componenti Celeste = nebulizzatori del substrato collegati in serie (pressione di esercizio stimata 2 Bar). Rosa = superficie occupata dal filtro cellulare per bloccare l eluizione delle cellule eventualmente prodotte dal callo. Nero = valvole di regolazione del flusso (utili solo nella fase di sperimentazione).

14 Principi di funzionamento Percorso sustrato Celeste = L acqua viene pescata dal serbatoio dalla pompa adescante e successivamente pompata, attraverso i nebulizzatori, nel box. Arancione = Percorso di uscita dell acqua nella fase di scaricamento.

15 Principi di funzionamento Percorso aria Celeste = L aria viene pompata all interno di una scatola contenete il filtro HEPA dove avviene la sua filtrazione. Blu = l aria dopo essere passata dal filtro si immette nel box. Rosa = L aria scende lungo il tubo fino al serbatoio. Arancione = l aria fuoriesce dalla valvola di non ritorno (pressione di apertura 1,5 Bar).

16 Principi di funzionamento Il contenuto del serbatoio viene nebulizzato all interno del box, in questo modo è possibile ottenere una migliore distribuzione. Il filtro cellulare blocca gli ammassi eventualmente prodotti dalla stimolazione tramite ormoni, si previene così l occlusione dei nebulizzatori con conseguente aumento della pressione e rottura dell intero sistema. I due tubi in alto a destra permettono l insufflazione dell aria, necessaria per controllare l areazione degli espianti e per la fase di svuotamento del reattore, andando a colmare il vuoto formato dalla fuoriuscita del liquido nella fase di svuotamento.

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18 Possibili vantaggi 1. Il substrato liquido permette (rispetto al solido) un miglior assorbimento dei nutrienti da parte della biomassa. 2. Assenza del gradiente di concentrazione dei nutrienti sottostante all espianto (rispetto al solido) e quindi possibilità del mantenimento della coltura per un tempo prolungato. 3. Possibilità di sviluppare diverse fasi della morfogenesi diretta e indiretta senza spostare gli espianti, ma semplicemente caricando il serbatoio del reattore con un substrato diverso. 4. Gli espianti possono essere sterilizzati all interno del reattore stesso, non è quindi necessario l utilizzo della cappa sterile. 5. Possibilità di estrazione degli essudati dal substrato liquido. 6. Miglior sfruttamento del volume: è consentito l utilizzo di un alta densità di espianti poiché posizionati su piani sovrapposti. 7. Presenza di un supporto solido che favorisce l organogenesi (caratteristica comune alle normali colture su terreno agarizzato). 8. Aumento dalla capacità di areazione della biomassa rispetto ai normali bioreattori dove le cellule sono costantemente immerse nel substrato liquido. 9. Non necessitano l utilizzo di agar. 10. Possibilità di coltivare qualsiasi tipo di espianto (compresa coltura di meristemi).

19 Possibili applicazioni Una delle possibili applicazioni è la produzione di molecole di interesse farmacologico, la quale sintesi abbia bisogno di enzimi presenti nell apparato radicale o nel germoglio. Attraverso questo sistema infatti è possibile unire due caratteristiche, presenti sia nella colture su agar, che nelle colture in bioreattori: il contatto con un supporto solido, che favorisce l organogenesi (tipico delle colture in agar) e l utilizzo di un substrato liquido che favorisce l assorbimento dei nutrienti (tipico dei bioreattori).

20 Componenti: Pompa acqua 5w Pompa aria Filtro HEPA H14 Serbatoio Box propagazione Valvola non ritorno aria Valvola non ritorno acqua Tubi collegamento Gocciolatori Rubinetti Filo Supporti per filo

21 Box propagazione I gocciolatori posti sulla parte alta del box trasferiscono il liquido lungo i fili. Il tubo posto in basso a sinistra riporta il fluido nel serbatoio.

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23 Risultati

24 Visione esterna Si osserva un rigonfiamento nella regione del nodo di diramazione. Il colore in quella zona è di un verde più accesso.

25 Visione della sezione verticale Confrontando le due zone si nota un accrescimento maggiore dei fasci vascolari (xilema e floema) nella parte sinistra corrispondente alla zona rigonfia. Immagine x100 al microscopio con colorazione eosina. Viene rimarcata nuovamente la differenza di sviluppo dei fasci vascolari. L immagine in alto è mostrata la zona adiacente al rigonfiamento, mentre in quella in basso è mostrata la zona diametralmente opposta.

26 Visione della sezione orizzontale Immagine al microscopio x100 con colorazione eosina. Nelle due immagini è raffigurata la sezione orizzontale della zona rigonfia. Nella figura in basso si nota che la parte del rigonfiamento corrisponde alla zona dove il tessuto vascolare è a diretto contatto con il filo. Immagine al microscopio x100 con colorazione eosina. Nell immagine in alto viene mostrata la zona del rigonfiamento, mentre nell immagine sotto è mostrata una zona campione vicino al rigonfiamento. Si nota che nella prima immagine le cellule del cortex risultano ingrossate rispetto alla zona campione.