ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM)

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1 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM)

2 Vecchie biotecnologie Tutto in agricoltura è sempre stato geneticamente manipolato, le biotecnologie erano già una realtà nei campi dei nostri antenati del Neolitico. Si devono aspettare migliaia di anni per assistere ad un salto di qualità e quantità. Rivoluzione verde porta ad un aumento della produttività, essa è una realtà ancora attuale e in divenire La pratica che consideriamo tradizionale prevede tecniche come la mutagenesi indotta (usata per esempio per produrre il grano Creso e altre 2500 varietà) Limiti delle vecchie biotecnologie: pool genico limitato e tempi lunghi per esaminare il risultato. Oggi è possibile ridurre tempi attraverso la tecnica MAS (selezione assistita da marcatori). Si possono saggiare rapidamente centinaia di migliaia di discendenti.

3 OGM (organismi geneticamente modificati) Organismi la cui costituzione genetica (così come presente in natura) è stata modificata. Organismi viventi, nel cui genoma è stata introdotta una caratteristica che non è presente in quegli organismi in natura o, viceversa, è stata eliminata una caratteristica naturale. Generalmente sono organismi transgenici per l aggiunta di un gene prelevato da un altro organismo che codifica per una caratteristica di interesse.

4 Creazione piante GM Mediante Agrobacterium tumefaciens Si utilizza l Agrobacterium tumefaciens e la sua capacità naturale di infettare le cellule di una pianta. Si estrae dal batterio una molecola di DNA chiamata plasmide (Ti). Si inserisce nel plasmide il gene di interesse che vogliamo introdurre nella pianta (per esempio per la resistenza ad un parassita). Si introduce nel batterio di nuovo il plasmide così modificato (per elettroporazione). Si moltiplica il batterio facendolo riprodurre in provetta. Si infettano con l Agrobacterium tumefaciens così modificato, cellule di tessuto vegetale della pianta. Il plasmide modificato penetra nelle cellule vegetali ed il gene estraneo si trasferisce nel DNA della pianta. Perciò tutte le cellule che deriveranno per moltiplicazione da quelle infettate porteranno il gene estraneo. Buona parte delle specie vegetali può essere coltivata in vitro e con determinati bilanci ormonali nel mezzo di coltura si riesce a de-differenziare le cellule e riprogrammare l organogenesi (sia da callo o per embriogenesi). Da queste cellule modificate si fanno poi crescere in provetta le piantine che verranno poi trasferite in campo ed anche le piante che deriveranno da queste, per fecondazione, porteranno il gene estraneo.

5 Animali geneticamente modificati Differenza fondamentale dal mondo vegetale: 1) le cellule animali non possono originare un organismo intero in vitro; 2) le cellule animali non possono essere totalmente ri-programmate. (identità cellulare definita durante l embriogenesi, non durante lo sviluppo) Oltre agli embrioni, le uniche cellule che possono differenziarsi a diversi tipi cellulari, sono le cellule staminali che possono essere considerate pluri-potenti. Nel topo, le cellule staminali embrionali (raccolte dalla blastocisti) sono in grado di dare origine a tutti i tipi cellulari dell organismo adulto..

6 Introduzione DNA in cellule animali Esistono due approcci: 1) Micro-iniezione diretta di DNA all interno della cellula; La cassetta si integra in modo casuale nel genoma! Integrazione per RICOMBINAZIONE OMOLOGA: la cassetta si integra nel sito che contiene le sequenze complementari a quelle fiancheggianti la cassetta genica!

7 Micro-iniezione in uova di Zebrafish

8 Microiniezione nel topo Si induce super-ovulazione in una femmina donatrice (35-50 oociti) Dopo l accoppiamento, si prelevano gli ovuli fecondati e si inietta del DNA lineare direttamente nel pronucleo maschile (il nucleo delle cellule uovo -pronucleo femminile- è più piccolo di quello maschile) Gli ovuli iniettati vengono coltivati in vitro fino allo stadio di morula, poi vengono trasferiti in madri adottive pseudo-gravide (o surrogate) L organismo che nascerà sarà interamente formato da cellule trasfettate.

9 Introduzione DNA in cellule animali 2) Utilizzo di un «vettore» che normalmente è in grado di trasferire materiale genetico all interno delle cellule: i virus. In particolare, i virus «trasducenti» per i quali durante il ciclo infettivo è prevista l integrazione del genoma virale all interno del genoma della cellula ospite. Si definisce trasduzione l utilizzo di virus per il trasferimento di transgeni. Alcuni virus, i retrovirus, sono spesso utilizzati come vettori per introdurre nuovo materiale genetico all interno delle cellule. Si utilizzano i retrovirus perché il loro ciclo replicativo comprende l integrazione del genoma virale nel cromosoma dell ospite sotto forma di provirus.

10 Costrutto virale In laboratorio, parte del genoma virale viene sostituito con le sequenze di interesse. Si riescono a trasdurre frammenti di DNA che raggiungono 11 kb

11 PROBLEMI RELATIVI ALLA TRASFORMAZIONE GENETICA: 1. Distinzione tra trasformazione transiente (senza integrazione nel genoma) o stabile (il transgene si integra nel genoma) 2. Insorgenza di mutazione nel sito di inserzione l integrazione del transgene nel genoma della cellula bersaglio avviene in una POSIZIONE RANDOM, quindi possono insorgere «effetti di posizione» svantaggiosi o non desiderati (ad es, il transgene non si esprime) oppure si possono interrompere geni essenziali (ad es, la cellula che ha integrato il transgene muore) 3. Il transgene viene riconosciuto come non-self e man mano che le generazioni proseguono, subisce un processo di silenziamento (intervento epigenetico?) 4. (trasduzione) Creazione di nuovi ceppi virali, ottenuti per ricombinazione di sequenze virali già presenti nel genoma ospite, che ricombinano con la sequenza del virus ingegnerizzato; 5. Insorgenza di reazioni immunitarie dovute all attacco virale;

12 ANIMALI TRANSGENI Definizione: Sono animali nel cui genoma sono state inserite sequenze estranee di DNA, stabilmente incorporate nella linea germinale. Questo DNA è esogeno; se contiene un gene, questo è detto transgene. Ciò implica la possibilità di aggiungere nuove funzioni o di sopprimere informazioni genetiche endogene, tramite l incorporazione di porzioni di genoma mutate in modo puntiforme o ampiamente delete. Finalità: - studio della funzione e dell espressione genica (con il corretto contesto genetico e biologico), - creazione di modelli sperimentali di malattie in maniera predeterminata (a differenza di quanto avviene con mutagenesi casuale) - produzione di proteine ricombinanti.

13 ANIMALI TRANSGENICI Produzione La produzione di animali transgenici richiede l inserimento stabile del DNA esogeno nella linea germinale, o tramite trasfezione, o tramite infezione virale in una cellula embrionale staminale (ES) coltivata in vitro. Questo DNA esogeno, che porta una mutazione, sostituisce in tutto o in parte una copia del gene normale, grazie alla ricombinazione omologa.

14 Produzione di topi transgenici Se una molecola di DNA che porta un gene mutato viene trasferita in una cellula di topo, in genere si inserisce nei cromosomi a caso, ma circa una volta su mille sostituisce una delle due copie del gene normale per ricombinazione omologa. Sfruttando tale approccio qualunque gene specifico può essere alterato o inattivato in una cellula di topo mediante sostituzione diretta del gene. La tecnica funziona inserendo il gene mutato (clonato) in un vettore opportuno che permette di sostituirlo per ricombinazione specifica al gene omologo non mutato, all interno di una linea di cellule staminali embrionali di topo (cellule ES) prelevate dalla blastocisti. Le cellule ES che hanno incorporato il gene esogeno vengono inserite in un altro embrione precoce di topo che viene successivamente impiantato nell utero di una femmina acettrice. L embrione sarà costituito in parte da cellule contenenti il transgene e in parte no e si definisce chimera. Si selezionano le chimere che portano nella loro linea germinale cellule veicolanti il transgene. Tali topi sono allevati per produrre sia maschi che femmine, ciascuno eterozigote per la sostituzione del gene. Quando questi due topi sono incrociati a loro volta, un quarto della progenie sarà omozigote per il gene alterato. Studi di questi omozigoti permettono di esaminare la funzione del gene alterato o gli effetti dell eliminazione dell attività di un gene in assenza del gene normale corrispondente.

15 Cellule staminali embrionali TOPO CHIMERA

16 È necessario selezionare la progenie per avete topi con un genotipo omogeneo eterozigote o omozigote P1 P2 P1 P3 Il topo chimerico (P1) puo avere la mutazione nella linea germinale (in eterozigosi) oppure no. In P3 l assortimento genotipico segue le regole mendeliane per l incrocio tra due eterozigoti

17 L INGEGNERIA GENETICA E L ACCETTAZIONE PUBBLICA Transgene: Cisgene: Intragene: un gene ottenuto da un organismo differente, sessualmente incompatibile con l organismo ricevente. Quello che si ottiene è un organismo transgenico e geneticamente modificato. un gene derivante da un organismo appartenente alla stessa specie, o specie sessualmente compatibile, dell organismo ricevente. Il gene non può essere modificato, ma deve rimanere nella sua forma nativa. Quello che si ottiene è un organismo geneticamente modificato, ma non transgenico un gene «sintetico, ibrido» ottenuto combinando elementi genetici diversi, ma derivanti comunque da un organismo appartenente a specie sessualmente compatibile. I geni trasferiti non possiedono promotori e sequenze di terminazione, ma utilizzano quelle della pianta stessa. Cisgene e intragene non costituiscono una modificazione genetica nel senso comune del termine, quindi le piante ottenute con queste tecniche non dovrebbero essere considerate OGM. L UE non ha ancora deciso come classificarli. Tutti questi prodotti come si devono definire? Quasi OGM, ultra-ogm? To be or not to be transgenic

18 Vantaggi della Cis-Genesi Si utilizzano geni della stessa specie; Si ottengono nuove caratteristiche senza attingere a «background» differenti; Non ci sono rischi ambientali (fuga del transgene ); Non si introducono geni non desiderati (resistenza all antibiotico). Si ottengono risultati comparabili a quelli ottenuti con il breeding classico, evitando lo svantaggio di introdurre caratteri non necessari o peggiorativi;

19 GENOME EDITING Nuova frontiera delle biotecnologie: il Genome editing - ingegneria genetica mirata! Maurizio Martina, Ministro delle politiche agricole alimentari e forestali /maurizio-martina-perche-io-dico-no-ogm Vietare le vecchie colture transgeniche non significa essere oscurantisti e non volere un serio lavoro sul miglioramento genetico vegetale. In Italia, ad esempio, stiamo per sostenere iniziative di ricerca in laboratorio, a legislazione vigente, con tecnologie più sostenibili. Parlo di strumenti come il genome editing e l approccio cisgenico che ci possono consentire un impegno mirato di miglioramento genetico senza alterare le caratterizzazioni produttive di un sistema agroalimentare, migliorandone le performance anche rispetto alla resistenza alle malattie. Su questo fronte vogliamo concentrare i nostri sforzi di ricerca, in particolare pensando alle colture tipiche dell esperienza italiana, con l obiettivo di attestarci nei prossimi anni tra i paesi più avanzati nella gestione di tecnologie sostenibili. Sapendo anche che va condotta in Europa una discussione definitiva perché queste tecnologie vengano pienamente riconosciute diversamente dagli Ogm transgenici.

20 Elena Cattaneo, farmacologa, biologa e divulgatrice scientifica italiana, nominata senatrice a vita nel /troppe_bugie_sugli_ogm / Il dibattito. Il dibattito sugli Ogm da mesi è arenato su un falso problema. La tecnica del genome editing, insieme alla cisgenesi, viene definita più sostenibile (termine improprio per una tecnologia). Si dice che permetterebbe di andare oltre i vecchi Ogm (il transgenico) e di intervenire sulle piante senza ricorrere a geni di specie diverse. Non è esatto. Conosco bene questa tecnica. La uso in laboratorio per tagliare in modo mirato un preciso punto del DNA del topo e inserire un gene esogeno, cioè di un altra specie. Quindi con il genome editing si modifica il DNA di un organismo, come si vuole, anche inserendo o togliendo una sola lettera o un intero gene.

21 Genome Editing Consiste nella modificazione sito-specifica del genoma: Si basa sull utilizzo di una nucleasi (es FOK1 o CAS9) in grado di legare e tagliare il DNA. La nucleasi viene indirizzata ad un sito specifico sul DNA coniugandola: a delle proteine che legano siti specifici sul DNA a degli acidi nucleici (RNA) complementari ad un sito preciso. Una volta che la nucleasi atterra sul sito identificato, opera un «nick» (rottura) sul DNA (non tollerata dalla cellula). A questo punto, entrano in azione i NORMALI meccanismi cellulari di RIPARAZIONE DEL DNA: la riparazione può avvenire mediante due modalità: - Saldatura delle estremità non omologhe - Ricombinazione non omologa - Ricombinazione omologa

22 1. «Saldatura delle estremità non omologhe» : rapida ed efficace, non si avvale di una molecola di DNA che funga da stampo, ma unisce estremità di DNA non protette; 2. «Ricombinazione omologa» : richiede la presenza di una molecola di DNA stampo identica (o quasi) a quella pre-rottura che può essere anche fornita esternamente. Questa modalità è meno efficiente rispetto alla precedente, ma è in grado di riparare il DNA introducendo al sito di taglio, la sequenza della molecola fornita come stampo.

23 Genome Editing Esistono tre approcci di Genome Editing: 1. Talen, 2. Zinc Finger 3. CRISPR/CAS9 N.B. Negli anni 90 si è scoperto che la frequenza di ricombinazione omologa poteva essere aumentata notevolmente introducendo un taglio nel sito da correggere, inizia così lacaccia al metodo adatto per provocare lesioni mirate

24 Sistema ZNF («zinc finger nucleases» - nucleasi basate su dita di zinco) Sistema che unisce una nucleasi batterica (enzima che taglia il DNA) alle dita di zinco (ogni dito è una catene proteica formata da circa 30 aa tenuti insieme da uno ione Zn) che si legano al DNA. Ogni dito interagisce con una tripletta di basi sul DNA Combinando dita diverse è possibile indirizzare la nucleasi verso una sequenza specifica lungo il cromosoma e tagliare. Il tasso di ricombinazione omologa aumenta considerevolmente perché il danno induce la cellula ad attivare i meccanismi di riparazione nel punto desiderato con maggior efficienza Svantaggi: Ogni volta l enzima deve essere accoppiato a dita diverse Il procedimento è complesso Monopolio di una singola società (possiede ampia collezione di ZNF e i loro brevetti)

25 ZNF Nel sito di rottura si può inserire un gene di interesse

26 Sistema TALEN («transcription activator-like effector nucleases» - le nucleasi che mimano gli effettori dell attivazione transcrizionale) Proteine con strutture ripetute, ogni ripetizione riconosce una pase del DNA legate ad una nucleasi Nel sito di rottura si può inserire un gene d interesse

27 CRISPR Cas9 Come spesso avviene, il sistema conosciuto come CRISPR system è un sistema batterico che permette ai microorganismi di difendersi dall infezione fagica (sistema immunitario procariotico). Negli ultimi anni, il sistema è stato ingegnerizzato ed è sfruttabile per la modificazione sitospecifica del genoma di una cellula. CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeats, traducibile in italiano con brevi ripetizioni palindrome raggruppate e distanziate da intervalli regolari Nel genoma batterico esistono porzioni nelle quali si riconoscono pezzetti di genomi virali distanziati da intervalli regolari di sequenze palindrome ripetute (in bianco). A questo cluster, si associano sequenze che codificano per proteine che riescono ad interagire con il DNA e a tagliarlo. Rispetto alle tecnologie precedenti CRISPR: - è facilmente programmabile - la proteina è sempre la stessa è solo l RNA che la guida che deve cambiare (più facile ed economico da produrre). - Permette di editare più siti simultaneamente

28 CRISPR Cas9 Nella loro vita i batteri vengono infettati da virus che iniettano il loro genoma all interno del batterio. Elementi chiave: - La proteina CAS9 che è una nucleasi (taglia il DNA); - L RNA guida: è una molecola di RNA formata da due componenti: una si lega alla proteina CAS9, l altra è dovuta alla trascrizione dei pezzetti «spacers» dei genomi virali integrati; Il complesso CAS9/GuideRNA lega il DNA virale e lo taglia!

29 L infezione di una cellula batterica da parte di un virus fagico. Distruzione del DNA fagico invasivo tramite attivazione del meccanismo batterico CRISPR/CAS

30 Cosa succede una volta che si è creato il taglio nel genoma della cellula target? Se vogliamo INSERIRE UNA SEQUENZA NOTA, dobbiamo avere un DNA donatore: viene coinserito durante la trasformazione della cellula target e ( SI SPERA ) i meccanismi di riparo del DNA («per ricombinazione omologa») propri della cellula lo integrano nel sito di rottura. In animale è «facile»: 1% degli eventi di trasformazione conterrà il transgene di interesse al locus target In pianta non è «facile»: 0.01% degli eventi di trasformazione conterrà il transgene di interesse al locus target (in quanto le cellule vegetali NON utilizzano in modo efficiente il sistema di riparazione per ricombinazione omologa!)

31 Applicazioni della metodica del Genome Editing Studio della funzione genica: si può abbattere la funzione genica creando una linea cellulare nella quale un determinato gene non è più attivo, se ne può capire la funzione; Creare OGM: si può inserire in un sito «predeterminato» una cassetta genica per l espressione di un determinato gene. Si evitano i problemi di «effetto di posizione» e quelli derivanti dall integrazione random (in altri geni etc..) Potenzialmente, si possono integrare contemporaneamente geni diversi a loci separati; Applicazione in campo terapeutico: Malattie dovute ad infezione virale (il DNA virale diventa il bersaglio dell attività nucleasica, così come avviene in batterio; oppure sono target di mutazione i recettori cellulari che permettono l infezione virale) Malattie dovute a mutazioni/variazioni di singoli geni: «Gene therapy»;

32 Il Genome Editing non è ancora una metodica perfetta: Si deve migliorare l efficienza del meccanismo di riparazione per «ricombinazione omologa», piuttosto che per «giunzione delle estremità» (aumentando la quantità di DNA donatore ); si devono evitare inserimenti «off-target» (migliorando il disegno degli RNAguida..) e analizzandone l emersione in sistemi modello si devono studiare eventuali conseguenze «funzionali» alla presenza del sistema CRISPR/CAS nella cellula bersaglio si deve considerare la fitness della cellula bersaglio, che può essere debilitata dalla presenza del gene mutato l analisi delle cellule modificate via genome editing ex vivo è più semplice, e permette l identificazione delle cellule «migliori» (ad es, con meno eventi off-targets) da re-impiantare nel paziente Instabilità dei plasmidi nei batteri utilizzati in laboratorio: la sequenza nucleotidica degli enzimi utilizzati contiene sequenze ripetute che disturbano l organismo ospite (sia Escherichia coli che Agrobatterio).