Vettori per il clonaggio

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1 Vettori per il clonaggio 1. Plasmidi 2. Fagi 3. Cosmidi 4. Cromosomi artificiali batterici (BAC) 5. Batteriofago P1 (PAC) 6. Cromosomi artificiali di lievito (YAC)

2 Vettori e dimensioni degli inserti clonabili

3 Plasmidi o Rappresentano in natura una forma di DNA parassita o Talvolta possono passare da una cellula batterica all altra (mitosi e coniugazione) o Sono in grado di replicarsi all interno dell ospite o La resistenza agli antibiotici non è l unica proprietà che conferiscono ai batteri la resistenza a farmaci, ai metalli pesanti, ai raggi UV l'utilizzo di fonti di carbonio insolite o la fissazione di azoto inorganico nel suolo la produzione di proteine in grado di uccidere gli altri batteri la virulenza (plasmide T di Agrobacterium tumefaciens) o Sono presenti in copie multiple nella cellula batterica (cellula ospite) o EcolE1: presente nel numero di circa 15 copie nel batterio E. coli wild-type o molte centinaia di copie sono invece generate per i vettori ingegnerizzati

4 Plasmide ColE1 La maggior parte dei plasmidi più frequentemente usati nelle tecnologie ricombinanti deriva dal plasmide ColE1, presente naturalmente nei batteri di E. coli. Il nome deriva dal fatto che contiene un gene per colicin E1 (gene CEA). Le colicine sono tossine che vengono rilasciati nell'ambiente per ridurre la concorrenza di altri ceppi batterici. Il plasmide possiede anche informazioni genetiche per l'immunità derivanti dal gene imm. Inoltre, ha una serie di geni per la mobilità (mob). Le sue dimensioni e la presenza di un singolo sito di riconoscimento EcoRI, lo hanno candidato ad essere considerato un vettore per il clonaggio. Tuttavia possiede un limitato numero di marcatori genetici per la selezione dei cloni trasformati.

5 pbr322 il capostipite dei vettori plasmidici pbr322: derivato dai plasmidi RSF2124 e psc101 (Amp R e Tet R ) e pmb1 (ori) Sequenziamento e caratterizzazione di tutti i siti di restrizione (Watson 1988): 6 nel gene Amp R e 13 nel gene Tet R (clonaggio e piastramento in replica) Amp S Tet R Amp R Tet R Tet+ PstI ~CTGCAG~ ~GACGTC~ Utile sito di RE per clonaggio di code dg-dc con Terminal Deoxynucleotidyl Transferase

6 pbr322, non solo clonaggio: analisi della funzione di promotore di frammenti di DNA HindIII è posizionato nel promotore della resistenza alla Tetraciclina: Se le sequenze clonate hanno attività promotrice-simile, non si avrà inattivazione inserzionale. HindIII +amp +tet Clonaggio frammenti troppo grandi di DNA: instabilità plasmidica Widera et al. 1978

7 Vettori derivati dal pbr322 EcoRI Inserzione del gene per la resistenza al Cloramfenicolo Cm R

8 Gene reporter cloramfenicolo acetil transferasi (cat) Il gene cat è posto sotto l espressione di un promotore minimale (TATAbox) per l analisi di sequenze regolative della trascrizione. Cat conferisce resistenza all antibiotico cloramfenicolo marcato con C 14, che viene modificato dall enzima per acetilazione coi gruppi acetilici dell acetil-coa (cofattore essenziale). Le molecole mono- e di-acetilate derivate dall attività di cat sono analizzate per cromatografia su strato sottile (lastre TLC di silice) esposta a lastra autoradiografica. di-acetylated chloramphenicol mono-acetylated chloramphenicol unacetylated chloramphenicol pl. Upstream sequences

9 Vettori con il gene reporter Luciferasi per lo studio di sequenze ad attività promotrice

10 Vettori sviluppati con MCS: i puc

11 Batteriofago λ E un virus di E. coli. Il suo genoma è una molecola di DNA lineare a doppio filamento di 48.5 kb. le estremità presentano un estensione a singolo filamento di 12 bp complementari (sito cos), che ne consentono la circolarizzazione una volta entrato nell ospite. Le sequenze responsabili della Ricombinazione (att) Geni funzionalmente correlati sono raggruppati in regioni distinte ci (regolatore negativo), N e Q (regolatori positivi): Regolanti il passaggio dal ciclo lisogenico al ciclo litico N, cl (cii e ciii) e cro Sintesi del DNA (O, P) e i geni che codificano per proteine della Testa (Head) e Coda (Tail): Funzioni tardive (Q) Lisi dell ospite (S, R)

12 Ciclo lisogenico e ciclo litico del fago λ La trascrizione del fago λ: Precoce, il fago può scegliere la via del ciclo da intraprendere. La trascrizione procedendo verso dx attiva le funzioni di replicazione col gene cii e verso sn quelle di ricombinazione, col gene ciii. Questi geni consentono la sintesi del repressore ci, che regola negativamente la trascrizione precoce, inibendo i trascritti che partono da P L e P R. L RNApolimerasi batterica riconosce e lega i promotori dei geni N e cro. Il prodotto genico N consente il superamento di questo ostacolo su P R ed il passaggio alla fase intermedia. Intermedia, la trascrizione procede riguardando i geni red (fase intermedia iniziale). Il prodotto del gene Q consente, invece, il passaggio alla fase tardiva, producendo un effetto antiterminazione su P R e consentendo l espressione dei geni tardivi attraverso, comportando un elevato numero di molecole fasiche mature. Tardiva, attivata la sintesi delle proteine de packaging e del capside. 2. RNApol batterica 1. *Trascrizione ci Inibitore trascrizione precoce * 3. Intermedia Mutazione nel gene ci (ci857) lo rende sensibile alla temperatura, crescerà come lisogeno a temperature più basse e sarà indotto nel ciclo litico aumentando la temperatura, che inattiva ci. 4. Tardiva

13 Ciclo lisogenico e ciclo litico del fago λ Il DNA circolare del fago λ viene duplicato in questa fase come plasmidi (replicazione theta). Poi passa ad un modello di rolling circle e, infine, avviene il packaging Convivenza più o meno stabile con l ospite, DNA fago λ duplicato insieme al DNA cromosomico batterico; altri bateriofagi non si integrano come il P1 e in questa fase si duplicano come plasmidi 6 5 4

14 Replicazione del fago λ Quando il fago λ infetta il batterio le estremità coesive si appaiano formando una struttura circolare (il sito cos è sensibile alla temperatura, che le denatura) e i nicks sono riparati dalla ligasi batterica. L'integrazione del genoma fagico all'interno di quello batterico avviene presso una speciale regione. La sequenza precisa sul genoma di E. coli è chiamata attb (dall'inglese Bacterial attachment, sito di attacco batterico) ed è composta essenzialmente di tre segmenti, detti B-O-B'. La sequenza omologa sul genoma del fago è attp (dall'inglese Phagic attachment, sito di attacco fagico) ed è composta delle regioni P-O-P'. Il sito di attacco sul DNA del fago λ (attp) possiede solo 15 bp completamente omologhe al sito batterico (attb). La reazione operata dalla integrasi (INT, ricombinasi di λ) genera due nuovi siti di attacco, che fiancheggiano il DNA fagico inegrato (attr e attl). La proteina XIS (codificata dal fago) insieme alle proteine batteriche FIS e IHF procedono invece alla rimozione del DNA del fago λ.

15 Replicazione del fago λ Il DNA circolare del fago λ viene duplicato in questa fase come plasmidi (replicazione theta). Poi passa ad un modello di rolling circle generando una molecola di DNA lineare contenente un gran numero di copie genomiche continue. In questa modalità il fago si trova nel ciclo litico.

16 Replicazione theta del fago λ

17 Replicazione rolling circle del fago λ

18 Packaging del fago λ Il DNA lineare contenente un gran numero di copie genomiche continue del fago λ viene tagliato producendo le estremità cos. Le proteine sono assemblate in due strutture separate: testa (vuota, dove sarà poi inserito il DNA) e coda. Quindi il DNA viene impacchettato nella testa e poi viene inserita la coda. Clonando un DNA esogeno nel fago λ (49 kb) le sue dimensioni aumenterebbero, poiché la testa può contenere massimo 51 kb, sarà quindi necessario eliminare del DNA fagico, es. i geni del ciclo lisogenico (25%), ma per mantenerne la stabilità non si possono eliminare tutti i geni non essenziali. Il 75% del DNA fagico dovrà essere conservato, altrimenti non saranno prodotte le placche di lisi. Importante: nel clonaggio considerare bene i limiti del packaging!!

19 Packaging in vitro: molto efficiente Efficienza di trasformazione del DNA di λ con un inserto clonato: placche/μg di DNA Impaccamento in vitro 10 6 placche/μg di DNA Fagi λ mutanti in ceppi batterici adatti producono teste vuote Fagi λ mutanti in ceppi batterici adatti producono solo proteine della coda e del packaging

20 Clonaggio in fago λ (geni del ciclo lisogenico)

21 Crescita del fago λ

22 Trasformazione batterica con plasmidi vs. trasfezione con fago λ Colonie su agar selettivo Placche di lisi su tappeto batterico cresciuto su soft agar Processo meno efficiente, ma consente il clonaggio di frammenti di dimensioni maggiori

23 Vettore λ gt10 braccio sinistro braccio destro estremità cos Ha dimensioni ridotte (43,3 kb) consentendo l inserimento di 7,6 kb Estremità cos appaiabili a 37 C Sito unico di taglio EcoRI Clonando in EcoRI si produce un inattivazione inserzionale sul gene ci, generando quindi un repressore non funzionante, non si avrà il ciclo lisogenico, ma subito quello litico e la produzione di placche di lisi trasparenti (mentre i fagi senza inserto produrranno placche torbide) estremità cos

24 Vettore λ gt11 Contiene il gene per la β-galattosidasi (lacz) Sito di taglio EcoRI, che in questo caso è verso il 3 della β- galattosidasi (mentre nel plasmide puc18 era al 5 ): clonando in EcoRI si producono placche di lisi bianche su terreno X-gal. Inoltre, se il gene esogeno sarà inserito nello stesso frame di lettura, produrrà una proteina di fusione contenente la β- galattosidasi fusa col prodotto clonato ed utilizzabile come target di anticorpi anti-β-galattosidasi per lo screening delle placche ricombinanti). Dimensioni vettore 37 kb (51 kb-37 kb), clonabili 14 kb

25 Vettori λ di sostituzione EMBL4 Poiché si possono eliminare tutti i geni non essenziali, ma buona parte del DNA fagico dovrà essere conservato nelle sue dimensioni totali per produrre le placche di lisi, sono stati sviluppati vettori di sostituzione Usato un enzima di restrizione con due siti di taglio (BamHI), che taglia un frammento stuffer (14 kb). DNA digerito, va corso su gel e purificati i due bracci digeriti BamHI ciascuno contenente le estremità fagiche cos. estremità cos estremità cos

26 Vettori λ di sostituzione EMBL4 Clonaggio in Bam HI, inoltre il vettore è ricircolarizzabile alle estremità cos. Dimensioni braccia 29 kb, clonabili 22 Kb. Senza inserto, il vettore sarà troppo piccolo per il packaging, non produrrà placche di lisi, in quelle prodotte ci saranno solo fagi ricombinanti. Non sarà necessario defosforilare il DNA fagico prima della reazione di ligasi l inserto di DNA da clonare viene invece defosforilando si eviteranno i multimeri e si otterranno così solo fagi con 1 copia del gene (ottimale per la produzione di librerie geniche). Inoltre, il frammento stuffer può essere sostituito non necessariamente solo con DNA esogeno (da clonare), ma si può associare anche all inserzione di gene reporter (βgalattosidasi; cloramfenicoloacetil transferasi, luciferasi, Green Fluorescent Protein). BamHI

27 Vettori derivati dal fago λ: batteriofagi filamentosi M13 M13 è costituito da DNA a singolo filamento ed è maschio-specifico perché penetra nella cellula ospite attraverso il pilus. Usato in passato per produrre cloni di DNA a singolo filamento per il sequenziamento sfruttando il ciclo di replicazione di questo virus DNA fagico a singolo filamento entra nel batterio dal pilo F Replicazione prima del doppio filamento, poi con la trascrizione e produzione delle proteine fagiche, l aumento della proteina del capside (legante il DNA) inibisce la sintesi dell emi-elica complementare, la replicazione diviene così asimmetrica a singolo filamento 1000 fagi rilasciati ad ogni ciclo replicativo, fuoriescono dalla membrana batterica

28 Vantaggi dei vettori a singolo filamento Clonaggio non limitato dall impaccamento, aumento delle dimensioni dell inserto (teoricamente, fino a 6 volte quelle dell M13 wild type) Nella forma replicativa a doppio filamento può essere manipolato come un plasmide Facile determinazione dell orientamento dell inserto: facendo ibridizzare tra loro i cloni coi DNA ricombinanti ottenuti, generando prodotti facilmente riconoscibili, facile screening di elevato numero di colonie ricombinanti contemporaneamente Il vettore nella sua forma a singolo filamento può essere usato per: Sequenziamento diretto sul singolo filamento Produzione di DNA mutato: mutagenesi sito-specifica mediante oligonucleotidi Produzione di sonde d ibridazione a singola elica

29 Vettori derivati dal fago λ: batteriofagi filamentosi M13 Impiegati nel phage display, esibizione di una proteina clonata in M13 Esponendola sulla superficie del batteriofago, facile screening dei ricombinanti. Fab Fab

30 Fab (fragments antigen-binding) library Phage display è una tecnica di laboratorio per lo studio delle interazioni proteina proteina, proteina peptide e proteina DNA che usa dei batteriofagi per collegare le proteine con le informazioni geniche che codificano per esse. Con questa tecnica il gene codificante per la proteina d'interesse è inserito nel gene di una proteina di rivestimento del fago causando l'esposizione della proteina sull'esterno del fago, instaurando una connessione tra genotipo e fenotipo. Questi fagi recanti la proteina d'interesse possono quindi essere sottoposti a screening con altre proteine (es. anticorpi), peptidi o sequenze di DNA con l'obiettivo di individuarne possibili interazioni. In questo modo una vasta quantità di proteine può essere saggiata e amplificata in un processo di selezione in vitro analogo alla selezione naturale. Geni per gli anticorpi Fab I batteriofagi più usati per il phage display sono il fago M13 e il fago filamentoso fd, sebbene siano stati usati anche fagi T4 e lambda.

31 Cosmidi: per il clonaggio di genomi di dimensioni medio-piccole (o singoli geni) (non sufficienti per clonare l intero genoma umano) Vettori di clonaggio creati dall uomo. Uniscono alcune proprietà dei plasmidi e dei fagi: si replicano come i plasmidi poiché contengono la sequenza ori, ma si impaccano nelle teste proteiche a formare le particelle virali come i fagi poiché contengono le estremità cos. Elementi Strutturali importanti: Inizio di replicazione ori, non vi sono geni per la replicazione fagica o la lisi, quindi non si formeranno placche Sito cos, usato per packaging in vitro Polylinker (puc) Marcatori genetici selezionabili (resistenza all Ampicillina), per la selezione delle colonie ricombinanti Dimensioni del cosmide: ~5 kb, l inserto dovrà essere almeno di Kb per consentire il packaging (37-51 Kb totali) pwe15

32 Clonaggio in Cosmidi siti cos separati da un sito di restrizione per ScaI (linearizzazione mimante il fago): digestione ScaI e digestione BamHI digestione BamHI Se ricircolarizza, non avendo le dimensioni ottimali per il packaging non origina placche di lisi defosforilazione dei frammenti di DNA genomico per evitare il legame tra due frammenti, durante la reazione ligasica (non ci saranno inserti formati da multimeri)

33 Clonaggio in Cosmidi

34 BAC (Bacterial Artificial Cromosome) - usato nel shotgun Tipo di vettore chimerico che permette di inserire fino a 300 Kb di inserto, è stato creato usando come modello il plasmide F (fattore di fertilità responsivo della coniugazione batterica), grazie ai geni del fattore F che conferiscono al vettore una bassa percentuale ricombinazione interna è presente solo in 1 (o 2) copie come plasmide per cellula. E' molto stabile nelle generazioni, ottimale per la produzione di genoteche. Per la trasformazione batterica molto usata l elettroporazione. cosn, derivato dal fago λ loxp, derivato dal fago P1 cosn loxp HindII e BamHI Elementi strutturali importanti: 1. Geni regolatori derivati dal fattore F di E. coli: oris: origine di replicazione, consente la replicazione unidirezionale repe: replicazione plasmidica e regolazione del numero di copie para, parb: mantenimento di un solo vettore per cellula, corretta ripartizione durante la mitosi, mantenimento della stabilità 2. Resistenza al cloramfenicolo (Cm R ) 3. Segmento di clonaggio: BamH1 e HindIII: siti di clonaggio dell inserto per due enzimi di restrizione T7 e SP6: promotori fiancheggianti i siti di clonaggio per la eventuale generazione di sonde a RNA NotI, EagI, XmaI, SmaI, BglI e SfiI: siti di restrizione 4. alcuni BAC possiedono anche: CosN: sito di restrizione, tagliato dalla terminasi di fago lambda LoxP: sito di restrizione, tagliato dalla proteina CRE del fago P1 LacZ (beta-galattosidasi): per la selezione bianco/blu parb para pbac108l 6,9 Kb repe Cm R Resistenza al Cloramfenicolo oris

35 Clonaggio in BAC BamH1 e HindIII BamH1 e HindIII elettroporazione

36 PAC (P1 derived Artificial Chromosome) Combina le caratteristiche dei vettori BAC e del batteriofago P1 (simile al fago λ, presente nella forma non integrata), può avere inserti anche fino a 300 Kb, ma la dimensione più usata e meglio gestita dal vettore è di 150 Kb. IPTG Elementi strutturali: 1. P1 Replicon: consente la replicazione unidirezionale, 1 (o 2) copie per cellula conferendo al vettore una bassa ricombinazione interna e stabilità 2. Lytic Replicon: può però essere indotto al ciclo litico e ad una replicazione in multicopia con isopropyl beta-dthiogalactopyranoside (IPTG), poiché posto sotto il controllo trascrizionale del promotore del gene lacz IPTG-inducibile. 3. Resistenza alla Kanamicina (KanR) o altro antibiotico 4. PUC19Link: qui si inserisce il frammento da clonare 5. BamH1 o BamHI/ScaI: clonaggio 6. T7 e SP6: promotori fiancheggianti per eventuali sonde RNA 7. Sistema per la selezione positiva dei ricombinanti: il prodotto del gene SacBII (controllato dal promotore di E. coli) tossico per la cellula in presenza di saccarosio non può essere trascritto solo se presente l inserto do DNA espgeno 8. Gene codificante per pac, sito per il packaging del fago P1 9. LoxP: sito di restrizione, tagliato dalla ricombinasi CRE del fago P1 IPTG Usato nel Progetto Genoma Umano (Human Genome Project)

37 Clonaggio in PAC (DNA genomico di topo, uomo, drosofila) 1. L inserto ottimale è di kb 2. Digestione con gli enzimi SacI e BamHI, produce due braccia distinguibili (corto e lungo) e loro defosforilazione 3. Ligasi con l inserto di DNA genomico della lunghezza ( Kb) 4. Aggiunta di estratto proteico di packaging del fago P1, contenente PAC, una pacasi che riconosce il sito pac e taglia il DNA e lo inserisce nella testa, poi attacco delle code (packaging in vitro) tossina ScabII ScaI BamHI ScaI BamHI ScaI 85 Kb 100 Kb pac BamHI loxp loxp P rep Kan R P1Lyt Tet R +DNA genomico digerito ScaI e BamHI 1. I fagi prodotti sono usati per infettare batteri E. coli cre+. 2. La ricombinasi Cre che catalizza la ricombinazione sito-specifica tra due sequenze bersaglio, quelle sul fago sono di 34 bp (loxp), ricircolarizza il DNA iniettato nell ospite. 3. Grazie all origine P1 replicon, viene poi mantenuto in un basso numero di copie. La produzione di un numero elevato di copie è ottenuta invece inducendo con IPTG l operone P1 litico sotto il controllo del promotore del gene lac. Sito per l impaccamento Sito riconosciuto dalla ricombinasi

38 YAC (Yeast Artificial Cromosome): lievito come ospite per clonare genomi degli eucarioti superiori 1. ARS: Autonomously Replicating Region, sequenza di replicazione autonoma di lievito CEN: è una sequenza di 125 bp tratta dai cromosomi di lievito che permette una segregazione regolare dei vettori durante la mitosi delle cellule. 3. TEL: è una sequenza di 13 bp ripetuta molte volte. E tratta dai telomeri dei cromosomi di lievito e serve a dare stabilità al vettore Marcatori di selezione: geni implicati nella biosintesi di uno specifico nutriente, in genere un amminoacido. I marcatori più utilizzati sono: His3, Leu2, Trp1, Lys2, Ura3. Il ceppo di lievito utilizzato nella trasfezione deve essere difettivo per la via biosintetica in questione. I ceppi che hanno internalizzato il vettore vengono identificati per la loro capacità di complementare il difetto nutrizionale, pertanto vengono fatti crescere su un terreno privo dello specifico nutriente Resistenza ad un antibiotico: ampicillina Vantaggi: si possono clonare frammenti di DNA molto grandi (fino a 1 Mb) Svantaggi: i costrutti sono difficili da manipolare perché fragili e nell ospite tendono a ricombinare. 3 4

39 Clonaggio in YAC 1. Il vettore viene digerito con due enzimi, EcoRI e BamHI, che invece taglia due volte tra i telomeri, per la produzione dei due bracci che vengono defosforilati per impedirne la riassociazione 2. Digestione enzimatica del DNA genomico da clonare con gli stessi RE e selezione dei frammenti con dimensioni di kb 3. Reazione di ligasi per saldare i frammenti di DNA genomico ai bracci. La stabilità del vettore dipende dalle dimensioni dell inserto 4. Il vettore si può propagare anche nella forma lineare 5. Selezione dei ricombinanti con entrambi i marcatori portati sui due bracci. TEL TEL

40 Vettori fagemidi per la preparazione di sonde a RNA Sono caratterizzati dalla presenza di: 1. uno o più Promotori fagici per la trascrizione dell inserto, posto a monte del sito MSC (o avalle per produrre un mrna antisenso). 2. Sito multiplo di clonaggio (MSC) 3. Origine di replicazione ori 4. Regione intergenica di 454 bp del fago filamentoso F1 (M13), comprendente l origine di replicazione. L orientamento (+) o (-) di tale regione consente la produzione di ssdna 5. Gene per la resistenza ad un antibiotico (Amp R ) 6. Gene lacz per la selezione bianco/blu dei ricombinanti M13 M13 Caratteristiche dei promotori fagici T3, T7 ed Sp6: sono promotori molto forti, alta efficienza di trascrizione non sono riconosciuti dalla RNApol di E. coli le RNApol dei fagi T7, T3 ed Sp6 sono enzimi semplici da manipolare

41 Trascrizione in vitro di RNA T7 promoter Taglio con RE Il T7 promotore Il promotore SP6 Se presenti entrambi, il promotore SP6 se è posizionato sul lato opposto al sito di clonaggio multiplo e viene utilizzato per trascrivere RNA antisenso.

42 Vettori per la produzione di RNA: applicazioni 1 1. Preparazione di sonde ad RNA non marcate o anche radiomarcate, mediante trascrizione in vitro 2. Studi di struttura e splicing dell RNA 3. Preparazione RNA per produrre vaccini (RNA virali) 4. Guide RNA per il gene targeting 5. mrna per traduzione in vitro translation e microiniezione: produzione di esperimenti di RNA antisenso per studi modulazione dell espressione genica in modelli animali in vivo 4 3

43 Applicazioni del clonaggio molecolare Studio dell organizzazione del genoma (genome library) dell espressione genica (exon library; studio dell attività di promotori (vettori contenenti geni reporter) Produzione di proteine ricombinanti purificate (es. enzimi addizionati ai detersivi, ormoni per trattamenti terapeutici come somatotropina per il nanismo ipofisario, insulina per il diabete) Terapia genica Produzione di organismi transgenici (es. OGM, modelli di studio murini)

44 Applicazioni del clonaggio molecolare