Ricombinazione genetica omologa: scambio tra

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1 Ricombinazione genetica omologa: scambio tra sequenze di DNA con ampia omologia Ricombinazione sito specifica: scambi in corrispondenza di una determinata sequenza Trasposizione: un segmento di DNA che si sposta da una posizione ad un'altra del cromosoma

2 Il modello proposto in batteri è RICOMBINAZIONE OMOLOGA Amaldi

3 Amaldi

4 Figura 8.2A Modello originario di ricombinazione di Holliday innescato da tagli su un singolo filamento di DNA. Le due molecole di DNA omologhe sono indicate con colori diversi e le lettere maiuscole o minuscole (A, a; B, b; C, c) indicano forme alternative (alleli) di 3 ipotetici geni A, B e C. Per esempio, le sequenze di DNA dei 2 alleli A e a del gene A hanno un elevato livello di similarità (differiscono di qualche nucleotide) ma possono dare origine a fenotipi diversi. Le due molecole omologhe si appaiano (I) e la ricombinazione inizia con l introduzione di rotture a singolo filamento (II). I filamenti incisi possono staccarsi dal filamento complementare della stessa molecola di DNA e invadere la doppia elica di DNA omologa appaiandosi al filamento complementare. Nella figura l invasione è simmetrica e porta alla formazione di una giunzione di Holliday o chiasma (III). La giunzione di Holliday può ora scorrere sul DNA mettendo di fronte nei due filamenti di DNA sequenze non identiche (i due alleli B e b), formando delle regioni chiamate eteroduplex indicate dai due quadrati (IV). Per terminare l evento di ricombinazione, la giunzione deve essere risolta tagliando e risaldando i filamenti di DNA prodotti. Per visualizzare meglio i siti di taglio la giunzione viene ruotata dando origine a una struttura planare in cui i filamenti non sono più intersecati tra loro (V). Il sito di taglio indicato con X coinvolge i due filamenti di DNA che all inizio dell evento ricombinativo (II) non erano rotti. Al contrario, il sito di taglio indicato con Y avviene sui due filamenti di DNA che erano stati rotti per iniziare la ricombinazione. Dopo la risoluzione della giunzione e la saldatura dei filamenti tagliati si generano prodotti diversi a seconda che il taglio sia avvenuto nella posizione X oppure nella posizione Y. Nel primo caso le molecole di DNA ricombinanti prodotte (definite prodotti del crossing over o splice ) hanno portato a un riassortimento degli alleli adiacenti al sito di ricombinazione (Va), perché vi è stato uno scambio tra i geni A e C. Nel caso in cui il taglio avvenga nella posizione Y, le molecole di DNA ricombinanti contengono una porzione di DNA ibrido chiamata patch (Vb). Tale taglio non porta al riassortimento dei geni fiancheggianti la giunzione e dà origine a prodotti definiti prodotti del non-crossing over.

5 IL MODELLO DI HOLLIDAY PREVEDE IL PASSAGGIO DELLA MIGRAZIONE DEL CHIASMA Aa, Bb, Cc rappresentano i diversi alleli, con piccole differenze di sequenza, gli eteroduplex che contengono questi geni (inserto ingrandito) avranno alcuni mismatch

6 IL TAGLIO DELLA GIUNZIONE DI HOLLIDAY Per la quantità di DNA che viene scambiata tra le due molecole che ricombinano è di importanza fondamentale quale delle due coppie di filamenti di DNA della giunzione di Holliday viene tagliata

7 Sistema di riparazione dei mismatch per la correzione degli errori (batteri) MutS si chiude sul mismatch, l attività ATPasica di MutS catalizza l idrolisi di ATP. Recluta MutL e MutH e MutH produce un nick in corrispondenza del mismatch. Una esonucleasi digerisce un tratto di filamento interrotto e la DNA Pol ricostruisce Watson

8 Il modello di Holliday per la ricombinazione omologa CHIASMA

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10 Trasferimento solo di un breve tratto di filamento Scambio reciproco dei filamenti = CROSSING OVER Genomi

11 Amaldi

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13 DBS = doublestranded breaks Formazione di un intermedio di ricombinazione con due giunzioni di Holliday Watson

14 L intermedio può essere risolto in 2 modi

15 Riparazione di una forcella di replicazione interrotta grazie alla ricombinazione omologa

16 Si verifica solo negli eucarioti che si riproducono mediante l unione di gameti femminili e maschili Il crossing over risulta in uno scambio uguale e reciproco dell'informazione genetica tra cromosomi omologhi Gene come unità di scambio Ciascuno dei due cromatidi di un cromosoma può andare incontro a crossing over con entrambi i cromatidi dell'altro cromosoma

17 Cox Per gameti ricombinanti si intendono gameti con combinazioni alleliche diverse da quelle dei genitori.

18 La diversità genetica può essere dovuto anche all assortimento indipendente dei cromosomi durante la meiosi. L assortimento indipendente può determinare gameti con qualsiasi combinazione di alleli in ciascun cromosoma

19 PROTEINE DELLA RICOMBINAZIONE MEIOTICA Watson SPO11 introduce nel DNA delle rotture a doppio filamento, taglia in molti punti sul cromosoma, con poca selettività di sequenza ma grande specificità temporale MRX processa le estremità tagliate Dnc1 è una proteina che funziona specificamente nella ricombinazione meiotica

20 Sono necessarie due subunità di Spo 11 per generare una rottura a doppio filamento. Interviene l OH della tirosina

21 Morgan ha avanzato l idea che variazioni nel grado di associazione tra geni, misurato mediante frequenza di ricombinazione (RF) tra i geni, poteva essere messa in relazione con la distanza esistente tra i geni stessi. Questo concetto aprì la via alla E possibile costruire le mappe genetiche perché: maggiore è la distanza tra i geni, maggiore è la probabilità che si verifichi il C.O. e interrompa la loro associazione. Più due geni saranno vicini minore sarà la loro frequenza di ricombinazione. Per questo la RF è direttamente proporzionale alla distanza tra i due geni

22 La distanza in mappe geniche viene oggi misurata in unità di mappa um: 1 unità di mappa = 1% di ricombinazione fra due loci genici è la distanza tra coppie di geni per i quali viene prodotto 1 ricombinante su 100 (1 gamete su 100 è ricombinante) In onore di T.H. Morgan: 1 unità di mappa = 1 centimorgan (cm) L unità di di mappa non è una distanza fisica ma genetica! Rivelano l'associazione tra due o piu' locus (geni). Consente di mappare un gene sulla base dello studio della sua vicinanza ad un altro locus sullo stesso cromosoma La percentuale di ricombinazione varia da zero (assenza di scambio, quindi associazione completa fra due geni) = geni associati/concatenati; a 50 (combinazione indipendente fra coppie di geni).

23 Frequenza di ricombinazione è un indice della ricombinazione genica avvenuta tra due geni La RF sarà del 50% se: i due geni sono presenti su cromosomi distinti o sullo stesso cromosoma ma molto distanziati (a causa del fenomeno del crossing-over). 50%, corrisponde alla segregazione indipendente prevista dalla seconda legge di Mendel Il crossing over tra 2 geni avviene in tutte le meiosi, il 50% dei gameti sarà ricombinante e il 50% parentale si deduce che la massima frequenza di ricombinazione tra 2 geni è 50% quindi 50 cm. questa rappresenta anche la frequenza di ricombinazione tra geni localizzati su cromosomi diversi.

24 45% 5% 5% 45% Unità Morgan = 1% di ricombinazione 5% Ab 5% ab = classi ricombinanti 45% AB 45% ab = classi parentali A dista da B = 10 um Frequenza di ricombinazione= n ricombinanti/n totale X 100

25 Le lunghe distanze di mappa sono soggette agli eventi di crossing over multipli Relazione lineare tra frequenza di ricombinazione e distanza di mappa? Si, solo entro certe distanze perché quando i geni sono lontani aumenta la probabilità di eventi multipli di crossing-over: <20% distanza accurata; >20% si perde la linearità). Dopo una certa distanza fisica la frazione di ricombinazione non rispecchia più la distanza genetica per l esistenza di doppi crossing-over

26 Doppio Crossing Over il verificarsi contemporaneo di due crossing-over sugli stessi due cromatidi omologhi, ricostituisce la combinazione genica originale I cromosomi ricombinanti derivanti da doppi crossing over presentano una variazione solo a livello del gene intermedio

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28 A B D a b d Ad ad 10% ricombinanti A B D a b d Ab ab 35% ricombinanti A B D a b d Bd bd 25% ricombinanti A 35 B 25 D 10 Le distanze sono parallele alle frequenze, quindi possiamo stabilire l ordine dei tre geni A 10 D 25 B 35

29 L esame dei doppi crossing-over (classi fenotipiche meno frequenti) permette di dedurre quale gene si trova in mezzo

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31 La genetica- Campbell