Mappatura genetica Capitoli Appunti

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1 Mappatura genetica Capitoli Appunti

2 Le mappe genetiche Si basano sugli studi di linkage cioe sull analisi della segregazione alla meiosi di marcatori genetici. Se due o piu marcatori vengono ereditati preferenzialmente nelle combinazioni parentali si deduce che mappino nella stessa regione genomica Ricordate? L unita di mappa e il centimorgan (cm): 1cM indica che due locus ricombinano fra loro con una frequenza pari a Si assume che 1cM sia pari a ~1.Mb anche se la relazione diretta non c e : la mappa genetica puo essere piu lunga di quella fisica. In uomo ideale sarebbe poter mappare due geni malattia contemporaneamente ma per motivi ovvi cio non e possibile e per tale motivo si studiano e mappano i marcatore genetici e a seguire marcatori con loci-malattia

3 MARCATORI GENETICI 1. Un buon marcatore deve essere sufficientemente polimorfico in modo tale che una persona scelta a caso nella popolazione umana abbia alta probabilita di essere eterozigote. Per mappare un gene malattia e necessario avere a disposizione dei marcatori distanziati lungo tutto il genoma

4 Come fare il linkage e la mappatura genetica Distinguiamo cosa vogliamo mappare: - mappatura genetica tra marcatori - mappatura genetica di un locus malattia e marcatori genetici Il calcolo del linkage e quindi statistico: occorre una progenie numerosa e bisogna conoscere la fase (aplotipo) dei parentali. come si fa quando si vuole mappare un locus malattia visto che le famiglie umane sono di solito piccole? Si ricorre ad un calcolo probabilistico che si indica come lod score (Z), ma prima di questo devo poter riconoscere e contare i ricombinanti

5 alleli indipendenti Segregazione di alleli alleli associati Quanto ricombinano due alleli dipende da quanto sono distanti e cio indica anche una differenza nel loro stato di associazione

6 Cosa e la fase? Ricordate fase cis e trans? Accoppiamento e repulsione? Sono sinonimi operativi di aplotipo soprattutto quando si parla di locus corrispondenti a caratteri dominanti e recessivi

7 Funzione di mappa D= -1/ ln(1-θ) Funzione di Haldane D= 1/4 ln[(1+θ)/(1-θ)] Funzione di Kosambi 7

8 Ripuntualizziamo la definizione di gene il locus e una regione genomica la cui espressione porta ad un fenotipo: per cui e piu giusto parlare di locus-malattia che di gene-malattia. Il locus puo essere piu grande del gene molecolare. Il linkage si fa fra locus, non fra geni molecolari Aplotipo: genotipo del gamete. Se prendo in considerazione locus ognuno presente nella popolazione con alleli i genotipi possibili nei gameti sono: A1,B1,C1; A,B1,C1; A1,B,C; A1,B1,C; ETC... a priori non so chi sta con chi. Nelle popolazioni naturali solo l analisi della progenie mi dice quale era l aplotipo dei parentali e solo nei grandi numeri. Le cose si complicano ulteriormente quando non disponendo di fenotipi codominanti come i polimorfismi posso seguire i loci solo con caratteri soggetti alla dominanza e recessivita. Aplotipo: alleli in coupling con un set di marcatori strettamente associati In alternativa al termine aplotipo si usa spesso il termine fase

9 DEFINIZIONE DEI RICOMBINANTI (semplice se la fase e nota!) richiede che un genitore sia eterozigote ATTENZIONE: Non seguo alcuna malattia!!!! 9

10 Per definire la fase e necessario disporre di meiosi informative ATTENZIONE ALLA RICOSTRUZIONE DELLA FASE ATTENZIONE A DOVE STO CERCANDO DI COSTRUIRE LE FASE Fase: combinazione degli alleli di una regione che deriva da ciascun genitore. Meiosi informative: sono quelle che danno informazioni sulla provenineza dell allele e sull eventuale ricombinazione. a1a1 aa a1a a1a a1a a1a a1a aa4 a1a a1a a1a1 a1a4 non infor. non infor. infor. infor. 10

11 7,,,,7 Costruendo l aplotipo... la costruzione dell aplotipo si esegue guardando ed esservando dei marcatori polimorfici (mappatura genetica dei marcatori) SOLO DOPO se necessario e se e lo scopo della ricerca si guarda il carattere rosso (mappatura del locus malattia)

12 7,,,,7 I1 I II1 II 1 Costruendo l aplotipo...

13 7,, 7,, 7,,,,,,7,,7,,7,, Costruendo l aplotipo...

14 7,, 7,,,,,,7,,7,, I1 I II1 II I1 I II1 II 14 Costruendo l aplotipo...

15 7,, 7,, 7,,,, 7,,,,,,7,,7,,7,,,,7,, 7,,, 4,, 1, 7,,, 4,, 1, 7,,, 4,, 1,,,,7, 1, 4,,,,7, 1, 4,,,,7, 1,,4 Costruendo l aplotipo...

16 Linkage: fase di piu loci Possedere un particolare polimorfismo non vuol dire avere il fenotipo, lo studio di linkage e a livello di popolazione, serve ad individuare una regione non la mutazione Identificare i ricombinanti non e facile e spesso NON e possibile... in entrambi i casi si ricorre al LOD SCORE

17 Relazione tra distanza fisica e genetica Parliamo della mappa genetica tra marcatori genetici: è possibile contare i ricombinanti e non ricombinanti perché ho a disposizione tutta la popolazione e grandi numeri!!! La freq. di ricombinazione non e uguale tra maschi e femmine, quindi la mappa genetica differisce con il sesso Il cooperative Human Linkage Center (famiglie CEPH) ha stabilito la mappa di migliaia di loci, definendo la distanza di 400cM (000 Mb) per il genoma umano 1cM= pb Distanza fisica e genetica possono essere confrontate tra loro grossolanamente e forniscono distanze tra i geni molto diverse, sebbene correlate

18 Mappatura di un locus malattia vs marcatori: Linkage-lod score ATTENZIONE Nell uomo utilizzando i marcatori suddetti e avendo a disposizione tutti gli individui della popolazione sono state create le mappe genetiche, dove il numero dei ricombinanti è stato utilizzato per definire la distanza genetica. Quando però si vuole localizzare un gene malattia e si vuole eseguire una mappatura genetica si considerano come punti dell incrocio un marcatore ed il locus malattia e per questi elementi si valuta il LOD SCORE, una misura PROBABILISTICA dell associazione. Questo per il semplice motivo che per un locus malattia non si dispone di una popolazione in tera per farne al mappatura ma di pochi individui nelle loro famiglie.

19 Mappatura di un locus malattia vs marcatori: Linkage-lod score Il linkage e una relazione di vicinanza fra due loci ed e funzione della loro distanza. La definizione di un linkage fra due loci si basa su calcoli statistici che permettono di quantizzare la probabilta che i risultati ottenuti non siano dovuti al caso. Nel caso dell uomo l analisi della progenie di una singola famiglia raramente fornisce informazioni sia per lo scarso numero di meiosi sia per la difficolta di risalire alla fase. Bisogna mettere insieme i dati provenienti da piu famiglie. Odds ratio= P di un assortimento genetico in una progenie se i geni sono associati P di un assortimento genetico nella progenie se i geni sono indipendenti (1- Θ) n Θ r (1/) n+r Lod score: logaritmo in base 10 dei singoli rapporti di ogni famiglia, si possono cosi sommare. Un valore di indica linkage.

20 Mappatura di un locus malattia vs marcatori: Linkage-lod score LOD SCORE (Z): logaritmo della probabilita che i loci siano associati (data la frazione di ricombinazione θ) piuttosto che non associati (θ=0.). La probabilita complessiva di un gruppo di famiglie e il prodotto delle probabilta di ciascuna famiglia, percio la somma dei lod score. Z Frequenza di ricombinazione Per θ = 0., Z=0: infatti sono il rapporto fra probabilta identiche e log 10 (1)=0. Z=(1000:1) e la soglia per accettare il linkage con una probabilita di errore del %. Z=- esclude il linkage. Puo essere utile nel mappaggio di esclusione Z Odds ratio= P di un assortimento genetico in una progenie se i geni sono associati P di un assortimento genetico nella progenie se i geni sono indipendenti (1- Θ) n Θ r (1/) n+r

21 IL LOD SCORE E LA MISURA STATISTICA DEL LINKAGE Il LOD SCORE (Z) e una funzione della frazione di ricombinazione Vengono calcolati i valori di LOD SCORE per una gamma di valori di θ e ne viene stimato il valore massimo (Ž) La probabilità complessiva di linkage in un gruppo di famiglie è il prodotto delle probabilità in ciascuna famiglia, per cui i lod score di famiglie diverse, che sono logaritmi, possono essere sommati

22 PRINCIPALI VALORI DI LOD SCORE Tutti i lod score sono uguali a 0 per θ=0, poiché si sta misurando il rapporto di due probabilità identiche I due loci sono in linkage con una probabilità di errore del % quando Z e maggiore o uguale a, cioe quando la probabilità di linkage è mille volte laprobabilità che i due loci non siano concatenati I due loci non sono in linkages Z e minore di - Valori tra i due estremi non permettono conclusioni

23 Il lod score senza la conoscenza della fase (analisi di famiglie con NF1 ereditarieta AD) allele D/d e discriminante per la patologia... ma non sempre e cosi Non si puo stabilire con esattezza e quindi bisogna ricorrere al calcolo di probabilita : quale situazione e corretta? Valori di Lod score al variare di θ Z max non nota

24 Il lod score con la conoscenza della fase IN QUESTO CASO I FIGLI SONO TUTTI RICOMBINANTI Prob= (1-θ) 1/ Valori di Lod score al variare di θ Z max Fase nota Avendo informazioni sulla fase posso identificare i figli come ricombinanti o non ricombinanti. Il lod score che sostiene il linkage e due volte piu grande della fase sconosciuta Cmq c e bisogno di altre famiglie

25 Software per la mappatura genetica Per il calcolo dei lod score vengono usati i programmi LIPED e MLINK Il programma EXCLUDE trasforma i dati negativi di linkage in un diagramma delle possibili localizzazioni

26 LA MAPPATURA A PIU PUNTI DI UN GENE-MALATTIA Lo scopo è localizzare il gene in uno degli intervalli della mappa dei marcatori Viene usato il programma LINKMAP che ricava le posizioni del locus-malattia rispetto la griglia di marcatori, calcolando la probabilità complessiva dei dati di linkage per ciascuna delle posizioni possibili

27 IL RISULTATO Il risultato che si ottiene e una curva di probabilità rispetto alle localizzazioni di mappa Il picco più alto indica la posizione più probabile del locus malattia Le regioni in cui la curva si trova al di sotto del valore di - vanno escluse dall analisi

28 Linkage (mappartura locus-malattia) possibili inconvenienti Ci possono essere inconvenienti che complicano la possibilita di assegnare un locus a una regione definita da marcatori: Errori umani: errata lettura dei dati, scambio di campioni, paternita O DIAGNOSI SBALGIATE Errori nell interpretazione del fenotipo: un falso ricombinante.se i marcatori sono molti e vicinila presenza di un doppio ricombinante fa sospettare un errore problemi che limitano il numero di calcolo negli alberi genealogici (effetto sull attendibilita del lod score) Eterogeneita genetica: famiglie con fenotipo simile vengono accorpate e non si riesce a trovare il linkage. Sclerosi tuberosa: due loci distinti

29 In sintesi la mappa dei geni per linkage nell uomo 1. Arruolamento di numero sufficiente di famiglie (difficile per malattie rare o affetti muoiono in giovane eta ). Definizione attenta nella famiglia di chi e affetto e chi no (attenzione all eterogeneita di locus e espressivita variabile). I campioni di DNA degli individui nella famiglia sono analizzati per i vari marcatori 4. Per ciascuno per marcatori polimorfici viene cercata indicazione di linkage con il gene malattia. Si cercano i marcatori piu strettamente associati al gene patologico (θ=0) per definire la regione piu piccola possibile (definibile mediante linkage) approcci diversi dovranno essere utilizzati per identificare i geni realmente responsabili della patologia... prox lezioni