Cenni al controllo dell espressione genica

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1 / #bookContentViewAreaDivID Cenni al controllo dell espressione genica Biotecnologie_2012 Il controllo differenziale della trascrizione e della traduzione è alla base delle alterazioni della funzione cellulare (1) I geni codificano per le proteine e le proteine dettano la funzione delle cellule: Le migliaia di geni espressi da una cellula determinano quello che la cellula farà. Ogni passo del flusso di informazioni dal DNA al RNA alla proteina dà alla cellula un potenziale punto di controllo per autoregolare le sue funzioni e aggiustare la quantità e tipo di proteina che sintetizza. Ad ogni momento, la quantità di una data proteina riflette l equilibrio fra le vie biochimiche sintetiche e degradative. Come viene regolata l espressione genica? (1) Le quantità e tipo delle molecole di mrna di una cellula riflettono la funzione di quella cellula: Ogni secondo vengono prodotti migliaia di trascritti in ogni cellula. Il principale punto di controllo dell espressione genica si trova di solito subito all inizio del processo di produzione della proteina: l inizio della trascrizione della molecola di mrna. La trascrizione del RNA fornisce un un efficiente punto di controllo dato che da una singola molecola di mrna si possono ottenere molte proteine. Come viene regolata l espressione genica? (2) Degradazione degli mrna Il processamento del trascritto fornisce un ulteriore livello di regolazione per gli eucarioti, e la presenza del nucleo rende cià possibile. Nei procarioti, la traduzione di un trascritto inizia prima che la trascrizione sia completata, a causa della vicinanza dei ribosomi alle nuove molecole di mrna. Al contrario, negli eucarioti, i trascritti sono modificati nel nucleo prima di venire esportati nel citoplasma per la traduzione. Le cellule riescono rapidamente ad aggiustare i loro livelli di proteine mediante degradazione enzimatica degli RNA trascritti e delle proteine esistenti. 1

2 Trascritti degli eucarioti I trascritti primari sintetizzati dalla RNA polimerasi contengono sequenze che non faranno parte del mrna maturo: Introni: vengono rimossi prima che il mrna maturo lasci il nucleo. Le rimanenti regioni del trascritto, che includono le regioni codificanti le proteine, esoni, vengono «spliced» per dare il mrna maturo. Negl i eucarioti i trascritti vengono inoltre modificati alle estremità, processi che influenzano la loro stabilità e traduzione. Come fanno le diverse cellule ad esprimere i geni di cui hanno bisogno? Ad ogni momento, soltanto una frazione dei geni viene espressa. La gran diversità dei profili di espressione genica, caratteristica dei vari tipi cellulari, si manifesta perchè le cellule hanno diversi insiemi di regolatori della trascrizione. Alcuni lavorano per aumentare la trascrizione mentre altri per impedirla o sopprimerla. Modulazione della trascrizione. Una proteina attivatrice legata al DNA a livello di una sequenza enhancer a monte può attrarre alla regione del promotore delle proteine che attivano la RNA polimerasi (verde) e quindi la trascrizione. Il DNA può fare un ansa su se stesso favorendo l interazione fra una proteina attivatrice e altre proteine che mediano l attività della RNA polimerasi. Normalmente la trascrizione inizia quando una RNA polimerasi si lega ad una sequenza promotore sulla molecola del DNA. Questa sequenza è quasi sempre localizzata appena sopra il punto dell inizio per la trascrizione (verso l estremità 5 del DNA), ma può anche essere localizzata a valle (verso l estremità 3 ). Altre sequenza del DNA, sequenza «enhancer», giocano un importante ruolo nella trascrizione, fornendo siti per il legame di proteine regolatrici che influenzano l attività della RNA polimerasi. Il legame delle proteine regolatrici ad una sequenza «enhancer» provoca un alterazione della struttura della cromatina che o promuove o inibisce il legame della RNA polimerasi e il legame del fattore di trascrizione. Una struttura della cromatina pià lassa (EUCROMATINA) è associata ad attiva trascrizione genica. Una struttura più compatta della cromatina (ETEROCROMATINA) è associata ad inattività trascrizionale. La struttura a nucleosomi della cromatina: Ogni nucleosoma contiene 8 proteine istoniche (blu) e il DNA si avvolge attorno a queste strutture istoniche per ottenere una forma avvolta più condensata. Per meglio accomodarsi all interno della cellula, lunghe porzioni del DNA a doppio filamento si si impacchettano strettamente in strutture dette cromosomi. 2

3 La struttura della cromatina nell interfase: L eterocromatina è più condensata dell eucromatina. : Quanto più condensata è la cromatina tento meno è accessibile ai fattori di trascrizione e alle polimerasi. Alcune proteine regolatrici influenzano la trascrizione di geni diversi. Ciò avviene perchè esistono copie multiple dei siti di legame per le proteine regolatrici all interno del genoma di una cellula. Perciò, le proteine regolatrici possono giocare ruoli differenti su geni diversi: uno dei meccanismi mediante i quali le cellule riescono a coordinare la regolazione di molti geni contemporaneamente. Come fa l espressione genica ad aumentare o diminuire in risposta alle alterazioni ambientali? Nei procarioti, alcune proteine regolatrici sono spesso controllate dalla disponibilità di nutrienti. Ciò permette ai batteri di aggiustare i loro quadri di trascrizione in risposta alle condizioni ambientali. Inoltre, dei siti regolatori sul DNA dei procarioti si trovano vicino ai siti dei promotori della trascrizione. Esempi Battere con sovrabbondanza di aminoacidi che segnala l «accensione» di alcuni geni (es. di proteine che metabolizzano gli AA) e lo «spegnimento» di altri (es. di proteine che sintetizzano gli AA). Alcuni AA si possono legare a proteine che svolgono una regolazione positiva: attivatori. Le proteine attivatori si legano a siti regolatori sul DNA vicino alla regione del promotore, che fungono da interrutori on/off. Questo legame facilita l attività della RNA polimerasi e la trascrizione dei geni vicini. Allo stesso tempo, tuttavia, altri AA potrebbero legarsi a proteine di regolazione negativa («repressori»), che a loro volta si legano a siti regolatori sul DNA che di fatto bloccano il legame della RNA polimerasi. Controllo dell espressione genica negli eucarioti Repressione della trascrizione vicino alla regione del promotore. Alcune molecole possono interferire con il legame della RNA polimerasi. Una proteina repressore inattiva (blu) può diventare attivata da un altra molecola (cerchio rosso). Questo repressore inattivo può legarsi ad una regione vicino al promotore detta operatore (giallo) e quindi interferire con il legame della RNA polimerasi al promotore, di fatto impedendo la trascrizione. Molto più complesso che nei procarioti. Di solito è coinvolto un numero molto maggiore di proteine regolatorie, e i siti di legame regolatori possono essere localizzati in posizioni abbastanza lontane dai siti dei promori della trascrizione. Inoltre, l espressione genica negli eucarioti è di solito regolata da una combinazione di varie proteine regolatorie che lavorano insieme, il che permette una maggiore flessibilità nel controllo dell espressione genica. 3

4 Le sequenze «enhancer» sono sequenze di DNA a cui si lega una proteina attivatrice, e che si possono trovare a migliaia di coppie di basi dal promotore, sia a monte che a valle del gene. Si pensa che il legame della proteina induca il DNA a formare delle anse, avvicinando la proteina alla RNA polimerasi e ad altre proteine del complesso che promuovono l inizio della trascrizione. Tessuti diversi esprimono insiemi caratteristici di regolatori della trascrizione: Quando gli organismi multicellulari si sviluppano, gruppi diversi di cellule all interno di questi organismi accendono o spengono combinazioni specifiche di regolatori. Tali quadri dipendenti dalla fase dello sviluppo sono responsabili della grande diversità di tipi cellulari presenti negli organismi adulti. La complessità dei regolatori multipli. I regolatori della trascrizione possono avere singolarmente un ruolo diverso. Le combinazioni di uno, due o tre regolatori (forme blu, verde e giallo) possono influenzare la trascrizione in modi diversi, influenzando in modo differenziale un complesso mediatore (arancione), anche sso composto di proteine. L effeto è che lo stesso gene può essere trascritto in modi diversi, a seconda della combinazione, presenza o assenza delle diverse proteine regolatorie della trascrizione. I regolatori della trascrizione possono determinare I tipi cellulari. La gran varietà di tipi cellulari in un singolo organismo può dipendere dall attività diversificata dei vari fattori di trascrizione in ogni tipo cellulare. Fattori di trascrizione differenti possono accendersi in momenti diversi durante le successive generazioni di cellule. Man mano le cellule maturano e proseguono lungo I diversitadi di sviluppo (frecce), dei fattori di trascrizione (cerchi colorati) possono agire sull espressione genica e modificare le cellule in modi diversi. Questo cambiamento influenza la generazione successiva di cellule derivate da quella cellula. Nelle generazioni succesive, è la combinazione dei diversi fattori di trascrizioone che alla fine determina il tipo cellulare. Fattori di trascrizione Proteine che si legano a sequenza specifiche del DNA così controllando il flusso ( o la trascrizione) dell informazione genica dal DNA al mrna. I fattori di trascrizione svolgono questa funzione da soli oppure associati ad altre proteine di un complesso promuovendo (come attivatori) o bloccando (come repressori) il reclutamento della RNA polimerasi (enzima che svolge la trascrizione dell informazione genetica dal DNA al mrna) a geni specifici. Un fattore caratteristico dei fattori di trascrizione è che essi contengono uno o più domini di legame al DNA («DNA Binding Domains», DBDs) che si legano a sequenze specifiche del DNA adiacenti ai geni che regolano. Proteine aggiuntive quali i co attivatori, i rimodllanti della cromatina, le acetilasi o le deacetilasi degli istoni, le chinasi e le metilasi, nonostante giochino anche esse ruoli cruciali nella regolazione genica, mancano di domini di legame al DNA e quindi non vengono classificati come fattori di trascrizione. Perchè è necessario regolare l espressione genica? Le cellule possono impedire che le risorse siano sprecate spegnendo i geni quando non sono necessari. La selezione naturale dovrebbe favorire la capacità di accendere o spegnere i geni. 4

5 I geni possono essere espressi con efficienza diversa La produzione di una proteina da parte di una cellula eucariotica. Il livello finale di ciascuna proteina in una cellula eucariotica dipende dall efficienza di ciascun passaggio raffigurato. Il gene A é trascritto e tradotto in modo molto più efficiente del gene B. Ciò fa sì che la quantità di proteina A nella cellula sia molto maggiore di quella della proteina B. /A1117/ Controllo dell espressione genica negli Eucarioti Controllo dell espressione genica (1) Viene spesso svolto mediante controllo dell inizio della trascrizione. Proteine regolatrici si legano al DNA sia per bloccare oppure per stimolare la trascrizione, a seconda del modo con cui interagiscono con la RNA polimerasi. Controllo dell espressione genica (2) Gli organismi procarioti regolano l espressione genica in risposta al loro ambiente. Gli eucarioti regolano l espressione genica per mantenere l omeostasi dell organismo. Proteine regolatrici (1) L espressione genica è spesso controllata da proteine regolatrici che si legano a sequenze specifiche del DNA. Le proteine regolatrici hanno accesso alle basi del DNA nel solco maggiore. Le proteine regolatrici possiedono motivi di legame al DNA. 5

6 Proteine regolatrici (2) Motivo Helix Turn Helix I motivi di legame al DNA sono sequenze amminoacidiche presenti nelle proteine regolatrici che si legano al DNA: Motivo helix turn helix Motivo homeodomain Motivo zinc finger Motivo leucine zipper Motivo Homeodomain (tipo particolare del dominio Helix turn helix ) Motivo Zinc Finger ge20.htm Motivo Zinc Finger (segue) Motivo Leucine Zipper 6

7 Regolazione nei Procarioti (1) I Procarioti hanno due livelli di controllo genico. I meccanismi trascrizionali controllano la sintesi del mrna e i meccanismi traduzionali controllano la sintesi delle proteine dopo che il mrna è stato prodotto. REGOLAZIONE DELL ESPRESSIONE GENICA PROCARIOTI Il controllo della trascrizione può essere: controllo positivo aumenta la trascrizione quando degli attivatori si legano al DNA. controllo negativo riduce la trascrizione quando dei repressori si legano a regioni regolatrici del DNA chiamate operatori Regolazione nei Procarioti (2) Le cellule procariotiche spesso rispondono al loro ambiente mediante altrazioni dell espressione genica. I geni coinvolti nella stessa via metabolica sono organizzati in operoni. Alcuni operoni sono indotti quando tale via metabolica è richiesta. Alcuni operoni sono repressi quando la via metabolica non è più necessaria. Nella E. coli sono stati identificati 75 diversi operoni che controllano 250 geni strutturali. Struttura generale di un operone Un operone contiene uno o più geni strutturali che di solito sono trascritti in un mrna policistronico: una singola molecola di mrna che codifica per più di una proteina. A monte dei geni strutturali c è una sequenza promotore che è il sito a cui la RNA polimerasi si lega e inizia la trascrizione. Vicino al promotore c è una sequenza di DNA detta un operatore, che è il sito del DNA dove una proteina repressore si lega per bloccare l inizio della trascrizione dall adiacente promotore. Un operone può anche contenere geni regolatori quali un gene repressore che codifica per una proteina regolatoria che si lega all operatore ed inibisce la trascizione. I geni regolatori non hanno bisogno di fare parte dell operone stesso, ma possono essere localizzati altrove nel genoma. La molecola di repressore raggiungerà l operatore pere bloccare la trascrizione dei geni strutturali. Operone batterico (1) Nei batteri i geni che codificano per una via metabolico sono di solito raggruppati insieme nel cromosoma, in un complesso funzionale detto operone. Tutti i geni di un operone sono controllati in modo coordinato (Jacob & Monod, 1961). Un tipico operone batterico è costituito da geni strutturali, da un gene regolatore e da due regioni con funzione di promotore e di operatore Vi sono due tipi di operoni nel DNA della E.coli: l operone lac e l operone triptofano: L operone lac è un operone inducibile che è sempre spento ma chè è attivato dall allactosio, una molecola induttrice. Esso controlla la degradazione del lactosio e produce enzimi inducibili. L operone triptofano è un operone repressivo che è sempre attivato e I disattiva soltanto in presenza del suo prodotto finale, l amminoacido triptofano. Questo operone produce enzimi per la sintesi del triptofano. I geni strutturali presenti nell operone triptofano codificano per gli enzimi che reprimono la sintesi. 7

8 Operone batterico (2): geni strutturali Geni strutturali: codificano per proteine necessarie per le normali operazioni della cellula. Per esempio, possono essere enzimi necessarie per degradare gli zuccheri o sintetizzare amminoacidi. I geni strutturali di solito sono raggruppati e la RNA polimerasi si muove da un gene strutturale al successivo, trascrivendoli tutti in un unico mrna. Questo lungo mrna (mrna policistronico) viene poi tradotto in polipeptidi distinti corrispondenti ai diversi enzimi della via metabolica. Perciò, l attivazione di un gene attiva anche tutti i geni codificanti per gli enzimi di un dato operone. Operone batterico (3): Promotore, operatore, gene regolatore Promotore: sequenza nucleotidica in cui la RNA polimerasi si lega al DNA prima di iniziare la trascrizione. Operatore: sequenza nucleotidica di solito localizzato in zona sovrapposta al promotore, serve di sito di legame per una proteina chiamata repressore. Il repressore è un es. di proteina regolatrice di geni, che riconosce una sequenza nucleotidica specifica del DNA e si lega ad essa con elevata affinità. Gioca un ruolo fondamentale per determinare se un particolare gene debba essere trascritto o meno. Gene regolatore: codifica per la proteina con funzione di repressore Operone batterico (4) La chiave per il controllo dell espressione dell operone sta nel repressore. Quando il repressore (proteina) si lega all operatore (sequenza nucleotidica) il promotore non è più disponibile per il legame alla RNA polimerasi e la trascrizione dei geni strutturali viene soppressa. La capacità del repressore di legarsi all operatore e di inibire la trascrizione dipende dalla conformazione della proteina, regolata allostericamente dal composto chiave della via metabolica (es. lattosio, triptofano). E la concentrazione di tale metabolita chiave che determina se l operone è attivo o inattivo in un dato momento. Due metaboliti fondamentali per la crescita batterica: Lattosio, triptofano Lattosio: disaccaride, composto di glucosio e galattosio, la cui degradazione ossidativa fornisce intermedi metabolici ed energia. Il primo passaggio del metabolismo (degradazione) è l idrolisi del legame β galattosidico fra i due zuccheri, catalizzata dall enzima β galattosidasi. Quando le cellule batteriche crescono in condizioni minime non hanno bisogno della β galattosidasi: Contiene circa < 5 copie di β galattosidasi e 1 singola copia del corrispondente mrna. Entro pochi minuti dall aggiunta di lattosio al terreno di coltura, le cellule contengono approssimativamente un n 1000 volte maggiore di molecole di β galattosidasi: La presenza di lattosio ha indotto la sintesi dell enzima β galattosidasi Operone lac (1) Enzima che idrolizza il legame glicosidico fra il galattosio e il glucosio del disaccaride lattosio, che poi vengono utilizzati per fornire energia mediante la glicolisi: lattosio Gruppo di geni che regola la produzione degli enzimi necessari per metabolizzare il lattosio nelle cellule batteriche. Operone inducibile: operone in cui la presenza di un metabolita chiave (lattosio) induce la trascrizione dei geni strutturali. Contiene tre geni strutturali in tandem: lacz, che codifica per la β galattosidasi lacy, che codifica per la lattosio permeasi, proteine che permette l ingresso del lattosio nella cellula laca, che codifica per la tiogalattoside transacetilasi (ruolo poco chiaro) 8

9 Lattosio presente Assenza di lattosio Lattosio entra nella cellula. Si lega al repressore (proteina) Cambia la conformazione del repressore Lo rende incapace di legarsi alle sequenze nucleotidiche dell operatore nel DNA I geni strutturali vengono trascritti Gli enzimi vengono sintetizzati Le molecole di lattosio vengono catabolizzate Presenza di lattosio Operone lac (2) In un operone inducibile conme il lac, la proteina repressore è in grado di legasi al DNA solo in assenza di lattosio, che agisce come induttore. Man mano che la concentrazione di lattosio nel terreno diminuisce il disaccaride si dissocia dal suo sito di legame sulla proteina repressore. Il rilascio del lattosio permette al repressore di legarsi all operatore. Viene bloccata la polimerasi che non può più raggiungere i geni strutturali e la trascrizione dell operone viene disattivata. Funzionamento dell operone lac D. Krogh: Biologia Oggi A (Cellula, Genetica, Evoluzione), Le Monnier, Firenze, 2006 Triptofano Aminoacido necessario per la sintesi delle proteine. La sua assenza richiede un investimento energetico per la sua sintesi. Le cellule che crescono in assenza di triptofano contengono gli mrna e gli enzimi necessari per la sintesi del triptofano. Se l amminoacido è presente nel mezzo le cellule non hanno più bisogno di sintetizzarlo. Entro pochi minuti si blocca la produzione degli enzimi responsabili per la sua produzione. Quindi, in presenza di triptofano, i geni che codificano per tali enzimi sono repressi. Operone trp (1) Operone reprimibile: il repressore non è in grado di legare il DNA operatore da solo. Il repressore è attivo come proteina legante il DNA soltanto quando è complessato con un fattore specifico, come il triptofano, che agisce da corepressore. 9

10 Operone trp (1) Contiene 5 geni strutturali: trp E, trp D, trp C, trp B, e trp A, che codifcano per la triptofano sintasi. Contiene inoltre un promotore che si lega alla RNA polimerasi e un operatore che blocca la trascrizione quando legato alla proteina sintetizzata dal gene repressore (trp R) che si lega all operatore Operone trp (2) Assenza di triptofano : il sito operatore è disponibile per legare la RNA polimerasi, che trascrive i geni strutturali dell operone trp consentendo la produzione di enzimi che sintetizzano il triptofano. Presenza di triptofano: gli enzimi della via biosintetica per questo AA non sono più necessari: L aumento della concentrazione di triptofano determina la formazione del complesso triptofano repressore che blocca la trascrizione. EUCARIOTI REGOLAZIONE ESPRESSIONE GENICA Controllo dell espressione genica negli Eucarioti Decine di migliaia di geni Molti tipi cellulari differenti Cellula batterica: quantità di DNA x codificare circa 3000 peptidi, 1/3 dei quali espresso in modo continuo. Cellula umana: molto + DNA (6 miliardi di coppie di basi), sufficienti x codificare diversi milioni di polipeptidi. Sebbene la maggior parte del DNA umano non codifichi x proteine, si stima che una tipica cell di mammiefero codfifichi x 5000 differenti polipeptidi in ogni momento. Molti di questi peptidi prodotti da «housekeeping genes» sono sintetizzati praticamente da tutte le cellule. Inoltre le cellule contengono proteine specifiche del loro stato differenziato. La regolazione dell espressione genica negli eucarioti è quindi estremamente complessa e ancora poco nota. Tipi di controllo negli Eucarioti L espressione genica negli Eucarioti è controllata da una grande diversità di meccanismi che vanno da quelli che impediscono la trascrizione a quelli che impediscono l espressione dopo che la proteina è stata prodotta. Il diagramma illustra cinque tipi di meccanismi generali che possono essere utilizzati. 10

11 Meccanismi di controllo dell espressione genica negli Eucarioti Trascrizionali: Impediscono la trascrizione. Post trascrizionali: Controllano o regolano il mrna dopo che è stato prodotto. Traduzionali: Impediscono la traduzione. Spesso coinvolgono fattori proteici necessari per la traduzione. Post traduzionali: Agiscono dopo che la proteina è stata prodotta. Trascrizione negli Eucarioti Per il funzionamento dei fattori di trascrizione sono necessari inoltre co attivatori e mediatori. I co attivatori e i mediatori si legano ai fattori di trascrizione e ad altre parti dell apparato di trascrizione. Regolazione negli Eucarioti (1) Il controllo dell espressione dei geni degli eucarioti richiede la presenza di proteine dette dei fattori di trascrizione. I fattori di trascrizione generali sono necessari per l inizio della trascrizione. Sono necessari per un giusto legame della RNA polimerasi al DNA. I fattori di trascrizione specifici aumentano la trascrizione in alcune cellule o in risposta a segnali. Regolazione negli Eucarioti (2) I fattori di trascrizione generali si legano alla regione detta promotore del gene. Indi la RNA polimerasi II si lega al promotore per iniziare la trascrizione nel sito start (+1). Gli Enhancers (intensificatori) sono sequenze di DNA a cui si legano fattori di trascrizione specifici (attivatori) per aumentare la velocità di trascrizione. Controllo della trascrizione negli Eucarioti (1) Il controllo agisce a tre livelli: Modulazione dei livelli e/o attività degli attivatori e repressori Alterazioni della struttura della cromatina guidata da attivatori e repressori Influenza diretta degli attivatori e repressori sull assemblaggio dei complessi di iniziazione Controllo della trascrizione negli Eucarioti (2) Eterocromatina: regioni condensate della cromatina nelle quali il DNA è relativamente inaccessibile ai fattori di trascrizione e ad altre proteine: L espressione genica è repressa. Repressione mediata dall eterocromatina ha luogo ad esempio nei telomeri dei cromosomi. Le interazioni di diverse proteine fra di loro e gli N terminali ipoacetilati degli istoni H3 e H4 sono responsabili per la repressione della struttura della cromatina in queste regioni. 11

12 Controllo della trascrizione negli Eucarioti (3) Alcuni repressori funzionano in parte mediante interazioni con i complessi delle istone deacetilasi, provocando la deacetilazione degli istoni dei nucleosomi vicino al sito di legame con il repressore. Ciò inibisce l interazione fra il promotore nel DNA e fattori di trascrizione generali, così reprimendo l inizio della trascrizione. Alcuni attivatori funzionano in parte mediante iinterazione con I complessi delle istone acetilasi, provocando la iperacetilazione degli istoni dei nucleosomi vicino al sito di legame con l attivatore. Ciò facilita l interazione tra il DNA promotore e I fattori di trascizione generali, così stimolando l inzio della trascrizione. Modelo del enhancesome che si forma nel enhancer del promottore per il β interferone. La proteina eterodimerica cjun/atf 2, IRF 3, IRF 7, e NF κb(un eterodimero di p50 and p65) si legano ai quattro lelementi di controllo del enhancer che ha 70 bp. Il legame cooperativo di questi fattori di trascrizione è facilitato da HMGI, che si lega al solco minore del DNA. Le proteine cjun, ATF 2, p50, e p65 sembrano tutte interagire direttamente con un HMGI legato nelle loro adiacenze. Il piegamento della sequenza enhancer provocato dal legame con HMGI è fondamentale per la formazione di un enhancesome. Diverse proteine che incurvano il DNA agisco in modo simile su altre sequenze enhancer. Struttura dei cromosomi degli Eucarioti (1) Il DNA degli eucarioti è impacchettato sotto forma di cromatina. La struttura della cromatina è direttamente correlata al controllo dell espressione genica. La strutturazione della cromatina inizia con l organizzazione del DNA in nucleosomi. I nucleosomi possono impedire alla RNA polimerasi II di avere accesso ai promotori. Struttura dei cromosomi degli Eucarioti (2) La Metilazione (aggiunta di CH 3 ) al DNA o alle proteine istoniche è associata al controllo dell espressione genica: Aggregati di citosine metilate si legano ad una proteina che impedisce agli attivatori di legarsi al DNA. Le proteine istoniche metilate sono associate alle regioni inattive della cromatina. Ruolo della deacetilazione e dell iperacetilazione sulle code N terminali nel controllo della trascrizione nel lievito (1) Ruolo della deacetilazione e dell iperacetilazione sulle code N terminali nel controllo della trascrizione nel lievito (2) A. Deacetilazione delle code N-terminali degli istoni diretta al repressore. Il dominio di legame al DNA (DBD) del repressore Ume6 interagisce con un elemento di controllo specifico a monte (URS1) del gene che regola. Il dominio di repressione di Ume6 (RD) si lega a Sin3, una subunità di un complesso multiproteico che include Rpd3, una istone deacetilasi. La deacetilazione delle code N-terminali in nucleosomi nella regione di legame con Ume6 inibisce il legame di fattori di trascrizione generali alla TATA box, in questo modo reprimendo l espressione genica. B. Iperacetilazione delle code N-terminali mirata all attivatore. Il dominio di legame al DNA di Gcn4 interagisce con sequenze attivatorie specifiche a monte (UAS) del gene che regola. Il dominio di attivazione di Gcn4 (AD) a questo punto interagisce con un complesso multiproteico istone acetilasi che include la subunità catalitica di Gcn5. La iperacetilazione conseguente delle code N- terminali degli istoni del nucleosoma vicino al sito di legame di Gcn4 facilita l accesso dei fattori generali di trascrizione richiesti per l inzio della trascrizione. 12

13 Acetilazione degli istoni A. Gli istoni della zona central del nucleosoma hanno domini «pieghe istoniche «che interagiscono con gli altri istoni e con il DNA del nucleosome, e code N terminali che si estendono al di fuori del nucleosoma. Le code N aminoterminale degli istoni centrali (ad es. l istone H3) vengono modificate dall aggiunta di gruppi acetilici (Ac) alle catene laterali di residui specifici di lisina. B. Attivatori e repressori trascrizionali sono associati a co attivatori e co repressori, che hanno attività rispettivamente di istone acetiltrasferasi ((HAT) e di istone deacetilasi (HDAC), rispettivamente. L acetilazione degli istoni è caratteristica della cromatina attivamente trascritta (eucromatina) e può indebollire il legame degli istoni al DNA o alterare le interazioni con altre proteine. Controllo della trascrizione negli Eucarioti (4) Fattori che rimodellano la cromatina provocano la dissociazione transitoria del DNA dai complessi istonici in una reazione dipendente dall ATP. Questi fattori quindi promuovono il legame di altre proteine leganti il DNA necessarie per che abbia luogo l iniziazione in alcuni promotori. Controllo della trascrizione negli Eucarioti (5) L assemblaggio altamente cooperative dei complessi di iniziazione in vivo di solito richiede diversi attivatori. Una cellula deve produrre l insieme di attivatori richiesto per la trascrizione di un dato gene se deve esprimere tale gene Controllo della trascrizione negli Eucarioti (6) Alcuni repressori inibiscono competitivamente il legame di attivatori o di fattori di trascrizione generali. Altri interagiscono direttamente con fattori di trascrizione generali o con attivatori. Le attività della superfamiglia di fattori di trascrizione recettori nucleari sono regolate da ormoni solubili nei lipidi. Il legame degli ormoni a tali fattori di trascrizione induce alterazioni conformazionali che modificano le loro interazioni con altre proteine. Controllo della trascrizione negli Eucarioti (7) Le attività di alcuni fattori di trascrizione sono regulate da fosforilazione indotta dal legamedi ormoni peptidici ai loro recettori sulla superficie cellulare

14 Regolazione post traduzionale (1) Il controllo dell espressione genica di solito coinvolge il controllo dell inzio della trascrizione. Tuttavia l espressione genica può essere controllata dopo la trascrizione, con meccanismi quali: RNA interference Splicing alternativo RNA editing Degradazione del mrna Regolazione post traduzionale (2) Il RNA interference coinvolge l uso di piccole molecole di RNA. L enzima Dicer frantuma un RNA a doppio filamento in piccoli frammenti di RNA: I micro RNAs si legano al RNA complementare per impedire al traduzione. I small interfering RNAs degradano alcuni mrna particolari prima della traduzione. RNA interference (1) Controllo dell espressione genica negli Eucarioti RNA INTERFERENCE 14

15 Regolazione post traduzionale (4) Gli introni sono spliced dai pre mrnas per produrre il mrna maturo che viene tradotto. Lo splicing alternativo riconosce diversi siti di splicing in diversi tipi tissutali. Gli mrna maturi in ogni tesuto possiedono esoni diversi, dando origine a prodotti polipeptidici differenti a partire dallo stesso gene. Kim and Rossi Nature Reviews Genetics 8, (March 2007) doi: /nrg

16 Regolazione post traduzionale (4) Il RNA editing crea degli mrna maturi che non sono veramente codificati dal genoma. Ad esempio: L apolipoproteina B esiste in 2 isoforme una isoforma è prodotta dall editing del mrna per creare un codone di stop Questo RNA editing è tessuto specifico Regolazione post traduzionale (5) Le molecole mature di mrna hanno tempi di emivita diversi a seconda del gene e della localizzazione tissutale dell espressione. Le quantià di polipeptidi prodotti a partire da un gene particolare possono essere influenzate dall emivita delle molecole di mrna. Degradazione delle Proteine Le proteine sono prodotte e degradata continuamente nella cellula. Le proteine che devono essere degradate sono marcate con la proteina ubiquitina. La degradazione delle proteine marcata con l ubiquitina ha luogo nel proteasoma. Il machinario per la degradazione delle proteine. Nella via dell ubiquitina prteasoma l energia dell ATP è utilizzata per marcare una proteina alterata con una catena di ubiquitina, marcandola per la distruzione. La proteina viene allora idrolizzata in piccoli frammenti peptidici dal proteasoma