LA FISSAZIONE E LA PROCESSAZIONE DEI CAMPIONI ISTOLOGICI CON SOSTANZE A BASE ALCOLICA: POSSIBILI VANTAGGI E PROSPETTIVE FUTURE.

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1 LA FISSAZIONE E LA PROCESSAZIONE DEI CAMPIONI ISTOLOGICI CON SOSTANZE A BASE ALCOLICA: POSSIBILI VANTAGGI E PROSPETTIVE FUTURE. Dott.ssa Marchi Barbara Biologa sanitaria

2 COMBINAZIONE TRA LA BIOLOGIA MOLECOLARE E L ANATOMIA PATOLOGICA Diagnostica Target therapy Studi retrospettivi Bio-banche di tessuto

3 FORMALINA al 10% = 4% di formaldeide in soluzione acquosa PONTI METILENICI FISSAZIONE ADDITIVA Lisina (Lys, k)

4 FORMALDEIDE - Smascheramento antigenico - Falsi negativi e falsi positivi in immunoistochimica Smascheramento troppo aggressivo. Smascheramento poco efficace. Emoto et al., 2005 Presenza di gruppi aldeidici liberi.

5 INTERAZIONI CON GLI ACIDI NUCLEICI (Metz et al., 2004)

6 FORMALDEIDE Falsi negativi e falsi positivi in immunoistochimica Parziale degradazione del DNA Introduzione di mutazioni artificiali durante l amplificazione del DNA Modesta degradazione dell RNA e difficoltà di estrazione Cancerogeno (IARC, 2004)

7 FISSATIVO A BASE ALCOLICA Etanolo o metanolo al 72% Usato in giusta concentrazione e con PEG opportuni reagenti additivi può essere impiegato come fissativo Polialcoli Buona conservazione di acidi nucleici Non cancerogeno Fissativo coagulante ma non additivo

8 FORMALINA..INOLTRE BASE ALCOLICA FISSAZIONE Lo xilene è un altro reagente altamente PROCESSAZIONE tossico e soprattutto neurotossico e sospetto cancerogeno. Metodo Sperimentazione Sostituti dello xilene tradizionalepoco tossici possono esserescala impiegatietanolo nelle>90% fasi di Disidratazione disidratazione crescente e chiarificazione dei (Ottix Shaper) degli alcoli campioni istologici con buoni risultati? Chiarificazionel usoxilene Alchile C5-C 12 È possibile combinato con fissativi (>40%), etanolo a base alcolica? (<25%) ed alcoli alifatici (Ottix Plus)

9 SPERIMENTAZIONE Carcinoma alla mammella Fondamentale lo screening dei pazienti che iperesprimono HER2 per il trattamento con il farmaco antitumorale Herceptin. Allo stato attuale ci sono numerose problematiche che interessano l immunoistochimica

10 FASI DELLA PREPARAZIONE Prelievo Fissazione Disidratazione Inclusione Taglio Colorazione Formalina Fissativo a base alcolica Alcoli crescenti e xilene Sostituti a base alcolica dello xilene

11 Preparato fissato in Preparato fissato e formalina con alcoli e xilene processato con reagenti a base alcolica Mammella

12 RECETTORI HER HER2 (c-erb) HER1 (EGFR) Herceptin HER3 HER4 Membrana cellulare Cascata Di Segnali Iper-espresso nel % tumori alla mammella FATTORE PROGNOSTICO E PREDITTIVO Nel 98% dei casi l i per-espressione è associata all amplificazione genica

13 COLORAZIONE IMMUNOISTOCHIMICA DI HER-2 70% 60% 50% Soluzioni a base alcolica Formalina 40% Casi 30% 20% 10% 0% Iper-espressione

14 3+ Preparato fissato in formalina e processato con alcoli e xilene 3+ Preparato fissato e processato con reagenti a base alcolica Diapositiva 32

15 2+ Preparato fissato in formalina e processato con alcoli e xilene 1+ Preparato fissato e processato con reagenti a base alcolica

16 COLORAZIONE IMMUNOISTOCHIMICA DI HER-2 20% 18% 16% 14% 12% overespressione della preoteina Amplificazione genica Casi 10% 8% 6% 4% 2% 0% fissazione a base alcolica fissazione con formalina Dati

17 0 / 1+ Preparato fissato in formalina e processato con alcoli e xilene 2+ Preparato fissato e processato con reagenti a base alcolica

18 COLON Sperimentazione di tali reagenti nel tessuto del colon-retto Si sono ottenuti buoni risultati L immunoistochimica sull EGFR è risultata maggiormente sensibile e specifica

19 Preparato fissato in formalina con alcoli e xilene Preparato fissato e processato con reagenti a base alcolica

20 RECETTORI HER HER2 (c-erb) HER1 (EGFR) HER3 Membrana cellulare Iper-espresso nel 80% dei tumori al colon FATTORI PROGNOSTICI E PREDITTIVI HER4

21 Preparato fissato in formalina e processato con alcoli e xilene Preparato fissato e processato con reagenti a base alcolica

22 Riassumendo.. Fissazione a base alcolica Coartazione dei tessuti ed artefatti nella colorazione e-e. Smascheramento antigenico blando e non indispensabile. Riduzione di falsi positivi e negativi in immunoistochimica. Fissazione con formalina Buona qualità dei preparati istologici. Smascheramento antigenico indispensabile. Falsi positivi e negativi confermati da analisi biomolecolari. Qualità di RNA e DNA estratto da preparati istologici diversamente fissati e processati?

23 ESTRAZIONE DEL DNA DNA ESTRATTO DA CAMPIONI FISSATI CON FISSATIVO A BASE ALCOLICA DNA ESTRATTO DA CAMPIONI FISSATI CON FORMALINA

24 AMPLIFICAZIONE DEL DNA FORMALINA FISSATIVO A BASE ALCOLICA bp 308bp 501/ / bp 308bp

25 ESTRAZIONE DELL RNA Fissativo a base Formalina alcolica Congelato in azoto liquido 28s 18s

26 AMPLIFICAZIONE DEL cdna A1 800/ B1 A2 B2 A3 C+ Time CReal B3 Campioni istologici per l estrazione dell RNA (sucessivamente retrotrascritto 615bpa cdna) Ct SNRPD3 Ct VEGFa Fissazione e processazione 1118 in sperimentazione 39,1 37, Congelati in azoto liquido e 501 conservati a C A1 0,5 B1 log A2 B2 38,5 A34 B3 log C+ C- 33, bp Amplificati di circa 150 bp Amplificati di circa 230 bp

27 VANTAGGI Riduzione dei tempi di indagine immunofenotipica e genotipica. Aumento di sensibilità e specificità nell analisi immunoistochimica. Riduzione dei costi di smaltimento e i relativi rischi di tossicità e cancerogenicità per gli addetti alle analisi. Analisi molecolari quantitativamente e qualitativamente migliori. POSSIBILI SVANTAGGI Work in progress Mantenimento dell antigenicità per tempi lunghi. Mantenimento della qualità dei preparati istologici. Possibili contaminazioni batteriche e virali. Inferiore del preparato istologico.

28 Fine

29 Grazie a tutti per l attenzione e la partecipazione.

30 Sonda locus specifica Gene: Her-2 17q11.2-q12 Lunghezza: 190 kb Fluorocromo: SpectrumOrange Cromosoma 17

31 Sonda centromerica CEP 17 Alfa-satellite 17p11.1-q11.1 Lunghezza: 5,4 kb Fluorocromo: SpectrumGreen Cromosoma 17

32 Her-2 NON AMPLIFICATO CEP17 LSI Her-2 2 segnali Her-2 = 1 2 segnali CEP17 Cromosoma 17

33 Her-2 AMPLIFICATO segnali Her-2 => 2 segnali CEP17 conteggio su almeno 60 nuclei neoplastici Diapositiva 14 Cromosoma 17

34 herceptin

35 Herceptin

36 Mammella Diapositiva 11

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38 Arginina (Arg, R) Lisina (Lys, k) FORMALINA al 10% = 4% di formaldeide in soluzione acquosa

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44 Iper-espressione RECETTORI HER Diapositiva 16

45 CASCATA DI SEGNALI PI3K P P Shc Grb 2 Sos Raf P AKT P Ras MAPKK GSK-3 MAPK RECETTORI HER TRASCRIZIONE GENICA 45

46 RECETTORI HER

47 Basi azotate

48 COLORAZIONE IMMUNOISTOCHIMICA DI HER-2 100% 80% Casi 60% Soluzioni a base alcolica Formalina 40% 20% 0% negativi 0 e 1+ iper-espressione di Her2 2+ e 3+ Diapositiva 13

49 DATI Fissazione in Formalina Amplificato Non amplificato Iperespresso Non iper-espresso Sensibilità= VP/ VP+FN= 0,82 Specificità= VN/VN+FP= 0,86 Fissazione a base alcolica Amplificato Iperespresso Non iper-espresso 5 0 Sensibilità= VP/ VP+FN= 1 Specificità= VN/VN+FP= 1 Non amplificato 0 45 Diapositiva 16

50 IHC/FISH concordance FISH FISH % 24% 89.3% 3% Overall concordance: 82% Mass R et al.: Proc ASCO 2000

51 FISSAZIONE CON FORMALDEIDE ORE PROCESSAZIONE CLASSICA FISSAZIONE ALCOLICA ORE E PROCESSAZIONE CON SOSTITUTI DEGLI ALCOLI CRESCENTI E XILENE

52 FISSAZIONE ALCOLICA ORE E PROCESSAZIONE per 6 ore CON SOSTITUTI DELLO XILENE FISSAZIONE ALCOLICA 24 ORE E PROCESSAZIONE per 6 ore CON SOSTITUTI DELLO XILENE FISSAZIONE ALCOLICA 24 ORE E PROCESSAZIONE per 3 ore CON SOSTITUTI DELLO XILENE