Controllo e monitoraggio della sicurezza e qualità

Transcript

1 Strategie innovative rispondenti ai bisogni delle imprese nel comparto degli ortofrutticoli della IV gamma STAYFRESH Controllo e monitoraggio della sicurezza e qualità Chiara Gorni, Donatella Allemand, Paola Mariani Convegno Conclusivo La valerianella di IV gamma, Milano, 4 Novembre 2014

2 Prodotti di IV gamma: specificità Alimenti vegetali freschi (orticoli e frutticoli) sottoposti a minime lavorazioni che pur mantenendo invariate le caratteristiche organolettiche e sensoriali del prodotto fresco permettono di ottenere un prodotto pronto da consumare e semplice da utilizzare L umidità dell imballaggio è condizione favorevole allo sviluppo di microorganismi La bassa temperatura, come antimicrobico, é difficile da mantenere in continuo e microrganismi possono svilupparsi Microrganismi patogeni per l uomo possono moltiplicarsi fino a livelli di rischio per i consumatori 2

3 Origine della contaminazione I patogeni più rilevanti per la IVgamma sono a trasmissione oro-fecale (connessi alla sfera animale), ma fonti dirette e indirette sono presenti in ogni fase del percorso dal campo alla tavola: pre-raccolta: suolo, acqua, concimi organici non ben compostati, contatto animale (incluso umano) raccolta: contatto umano e di altri animali, attrezzature di raccolta, contenitori e mezzi di trasporto, acqua post-raccolta: contatto umano, ambiente di lavorazione, contenitori e mezzi di trasporto, contaminazioni trasversali tra prodotti in fase di consumo 3

4 Fonti di contaminazione: batteri patogeni Microrganismi patogeni (contaminanti occasionali) Batteri: Salmonella sp, Escherichia coli (O157:H7), Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, Shigella sp, Aeromonas hydrophila Virus: epatite A, Noravirus Salmonella, Listeria ed E. coli O157:H7 sono i patogeni più comuni 4

5 Controllo e sicurezza: i test I test possono essere sia di tipo microbiologico classico che molecolare (DNA) Limiti dei test attualmente in commercio: tempistiche superiori alle 24-48h limitato numero di patogeni identificati per test (test monopatogeno) identificazione solo a livello di specie matrice da analizzare 5

6 Test molecolare multipatogeno Il test mira ad identificare simultaneamente la presenza dei seguenti patogeni: Salmonella spp. Listeria spp. Escherichia Coli Il test consente anche di discriminare tra i diversi ceppi di questi patogeni, in modo da poter rintracciare la fonte della contaminazione La sensibilità del test e le sue tempistiche di identificazione, in presenza di patogeni multipli, deve essere rispondente alla normativa vigente 6

7 Illumina GoldenGate 7

8 Disegno del test Polimorfismi per i geni maggiormente informativi sono stati identificati mediante ricerca in banca dati e sequenziamento di ceppi commerciali Sono state selezionate 144 sequenze per il disegno delle sonde ma alcune sono state scartate per motivi tecnici Il pannello finale comprende 106 sonde: 50 per Salmonella 18 per Listeria 38 per Escherichia Coli 8

9 Ceppi batterici identificati SALMONELLA agona gallinarum miami reading typhi rubislaw typhimurium anatum hadar montevideo senftenberg typhisuis stanleyville virchow derby heidelberg muenchen enteritidis mbandaka tennessee weltevreden dublin indiana naestved paratyphi A paratyphi B thompson wien duisburg infantis pullorum livingstone emek tilene ESCHERICHIA COLI O157 O111 O103 O145 O26 LISTERIA ivanovii seeligeri monocytogenes grayii monocytogenes Div. I monocytogenes Div. II monocytogenes Div. III 9

10 Validazione del test 157 ceppi batterici, di campo o provenienti da ceppoteche commerciali, sono stati testati con il pannello Illumina: 98 ceppi di Salmonella 18 ceppi di Listeria 41 ceppi di Escherichia Coli È stata verificata: ripetibilità qualità estrazione del DNA La sensibilità del test è stata valutata per: numero minimo di CFU/ml rilevate numero di patogeni rilevati contemporaneamente 10

11 Risultati della validazione Le ibridazioni con i singoli ceppi batterici hanno mostrato la specificità delle sonde disegnate Utilizzando sia estratti crudi che estrazioni di DNA con kit, i dati ottenuti sono risultati confrontabili tra loro + = + La ripetibilità del dato viene a mancare nel caso di contaminazioni inferiori a 20 CFU/ml o di miscele di DNA ottenute da più di 5 ceppi batterici 11

12 12 Limiti e prospettive L approccio tecnologico del test multipatogeno utilizzando la tecnologia GoldenGate, mostra tuttavia limiti di tempistiche (da campione ad analisi conclusa > 48h) e sensibilità (>20cfu/ml) I recenti progressi nelle tecnologie molecolari permettono di ipotizzare il trasferimento delle conoscenze sviluppate ad una piattaforma maggiormente rispondente alle esigenze di un ciclo produttivo, come un lab-on-chip o un sistema miniaturizzato di next-generation sequencing (es. MinIon)

13 Test monopatogeno completo La normativa riguardante i patogeni alimentari richiede generalmente la rilevazione del patogeno (Salmonella spp., E.Coli, Listeria monocytogenes) senza la necessità di una loro sierotipizzazione Tuttavia nel caso di Salmonella la norma UNI EN ISO 6579 richiede, oltre all isolamento del batterio, anche una conferma biochimica o sierologica delle colonie isolate I test attualmente in commercio non sono in grado di fornire una soluzione tutto in uno con tempistiche compatibili con un ciclo produttivo Il test sviluppato per Salmonella risponde a questa necessità di isolamento e sierotipizzazione con tempi di risposta che variano dalle 24 alle 48 ore 13

14 Razionale del test diagnostico 1. PCR per i 3 geni selezionati (InvA, SafC e FimA) 2. Purificazione delle singole bande di interesse InvA SafC FimA IAC (controllo di amplificazione interno) 4. Sierotipizzazione mediante confronto delle sequenze con database pubblici e database proprietario 3. Sequenziamento 14

15 Selettività: inclusione ed esclusione Test di inclusione Genere N ceppi testati Test di esclusione N diversi sierotipi PCR per geni FimA InvA SafC Salmonella / / /138 Inclusività 100%: tutti i ceppi testati di S.enterica presentano almeno 2/3 dei prodotti di PCR (2 geni su 3), S.bongori 1/3 dei prodotti di PCR Esclusività: 96% per il gene FimA 100% per InvA e SafC Esclusività: 100% post sequenziamento 15

16 Accuratezza diagnostica: specificità e sensibilità 25 g di valerianella 1CFU S.typhimurium LT2 250 ml BHI 16h a 37 C estrazione di DNA da 1 ml PCR per 3 geni µL 3µL 5µL 1µL 3µL 5µL 1µL 3µL 5µL 1µL 3µL 5µL 1µL 3µL 5µL 1µL 3µL 5µL FimA InvA SafC IAC Un alto grado di accuratezza diagnostica consente di rilevare in modo preciso e veritiero il microrganismo target in presenza di matrice biologica senza interferenza di microrganismi non target 16

17 Limite di rilevabilità 25 g di valerianella in 250ml di BHI + 1CFU S. typhimurium LT2 Incubazione 37 C, 150 rpm, prelievi a tempi prestabiliti PCR T=0h T=½h T=1h T=2h T=3½h T=4½h T=5½h Valerianella + S.typhimurium Valerianella FimA x x x x x x x InvA x SafC x x x x x x x FimA InvA SafC IAC x x x x x x x 17

18 Protocollo sperimentale Almeno 1 banda di interesse No bande interesse No Salmonella spp Riconoscimento sierotipo Sierotipizzazione in 48h in caso di sospetto positivo, risultati negativi in 24h 18

19 Vantaggi Il vantaggio di questo test è costituito essenzialmente dal fornire una unica soluzione per l isolamento e la sierotipizzazione, con tempistiche entro le 48h. Il test monopatogeno sviluppato per Salmonella può essere trasferito direttamente a laboratori di diagnostica in quanto è stato disegnato secondo le indicazioni ISO e risponde ai requisiti normativi (ISO 6579:2002, ISO 22174:2005, ISO 20837:2006, ISO 20838:2006) 19

20 Prospettive Attualmente il limite di questo test molecolare è costituito dalla presenza di falsi positivi nel caso di batteri morti. Utilizzo di trattamenti con molecole che bloccano il DNA delle cellule morte, come ad esempio il propidio monoazide (PMA) o altri specifici intercalati morto vivo PMA+luce bloccato non bloccato PCR Ref. Nocker et al., 2006 Amplificazione di RNA (presente solo nelle cellule vive) con tecnica NASBA (nucleic-acid sequence based amplification) vivo RNA 20 morto NASBA

21 21 Grazie per l attenzione