VEQ IN BIOLOGIA MOLECOLARE CICLO 2014

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1 VEQ IN BIOLOGIA MOLECOLARE CICLO 2014 Firenze 14 settembre 2015 Maria Grazia Colao

2 VEQ 2014 HBV DNA HCV RNA HIV RNA HCV genotipo 106 laboratori partecipanti

3 VEQ invio 3 campioni monoparametrici Campione 1 HIV RNA Campione 2 HCV RNA e genotipo Campione 3 HBV DNA 2 e 3 invio 3 campioni multiparametrici Campione 4 HIV RNA HCV RNA HBV DNA HCV genot Campione 5 HIV RNA HCV RNA HBV DNA HCV genot Campione 6 HIV RNA HCV RNA HBV DNA HCV genot Campione 7 HIV RNA HCV RNA HBV DNA HCV genot Campione 8 HIV RNA HCV RNA HBV DNA HCV genot Campione 9 HIV RNA HCV RNA HBV DNA HCV genot

4 VEQ 2014 risposte elaborate HBV HCV HIV HCV genotipo totale risposte elaborate VEQ 2014 Biologia molecolare HBV - HCV - HIV risposte elaborate invio 2 invio 3 invio

5 VEQ 2014 Gruppi di elaborazione dati Risultati QUALITATIVI TMA o PCR Risultati QUANTITATIVI bdna PCR End Point PCR Real Time Abbott PCR Real Time Taqman Roche Altre amplificazioni Real Time

6 VEQ 2014 metodi utilizzati VEQ 2014 Biologia molecolare HBV - HCV - HIV metodi utilizzati metodi qualitativi bdna PCR End Point 300 PCR Real time Abbott 250 PCR Real time Taqman Roche 214 Altre Real time genot LiPA genot RT-PCR genot Sequenziamento genot altro HBV HCV HIV genot HCV 14 17

7 VEQ 2014 Evoluzione dei sistemi di misura 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% VEQ Biologia Molecolare anno 2006 anno % % % altre real time PCR real time Taqman 51.0 PCR real time Abbott 32.8 PCR real time 47.9 PCR End Point bdna

8 VEQ 2014 metodiche manuali e automatizzate VEQ 2014 Biologia Molecolare automatizzata manuale ,2% estrazione DNA/RNA 2,5% amplificazione/rivelazione

9 VEQ 2014 Strumento per estrazione Strumento per amplificazione/rivelazione Ditta Abbott M 2000 SP Abbott R.T.7900 Abbott Cobas Ampliprep Cobas Taqman 48 Cobas Taqman 96 QiaCube Rotor Gene 3000 Rotor Gene 6000 Roche Artus/Qiagen Qiagen Versant sample prep Versant KPCR Siemens Versant 440 Siemens Easy Mag Real time PCR System Applera bio Merieux Magnesia 16 Montania 483 Anatolia GeneWork Applied Biosystem Gen Amp PCR 9700 ThermoFisher Scientific Genedia Life Gene Nuclear Laser

10 VEQ 2014: HIV RNA

11 copie/ml 2,000 1,500 VEQ 2014 HIV RNA Campione N 1 59 risultati quantitativi 1,

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13 copie/ml 2,000 1,500 VEQ 2014 HIV RNA Campione N 4 56 risultati quantitativi 1,

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17 copie/ml 1,500 1,000 VEQ 2014 HIV RNA Campione N 6 60 risultati quantitativi 500 0

18 copie/ml 4,000 3,500 3,000 2,500 VEQ 2014 HIV RNA Campione N 7 59 risultati quantitativi 2,000 1,500 1,

19 copie/ml 3,000 2,500 2,000 VEQ 2014 HIV RNA Campione N 8 59 risultati quantitativi 1,500 1,

20 copie/ml 2,000 1,500 VEQ 2014 HIV RNA Campione N 9 56 risultati quantitativi 1,

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22 VEQ 2014: HCV RNA

23 UI/ml 4,000 3,500 3,000 2,500 VEQ 2014 HCV RNA Campione N 2 genotipo 1a 84 risultati quantitativi 2,000 1,500 1,

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25 UI/ml 5,000 4,500 4,000 3,500 VEQ 2014 HCV RNA Campione N 4 genotipo 1a 81 risultati quantitativi 3,000 2,500 2,000 1,500 1,

26 UI/ml 5,000 4,500 4,000 3,500 VEQ 2014 HCV RNA Campione N 5 genotipo 1a 90 risultati quantitativi 3,000 2,500 2,000 1,500 1,

27 UI/ml 2,000 1,500 VEQ 2014 HCV RNA Campione N 6 genotipo 4 85 risultati quantitativi 1,

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29 UI/ml VEQ 2014 HCV RNA Campione N 7 genotipo 1a 82 risultati quantitativi

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33 UI/ml 1,500 1,000 VEQ 2014 HCV RNA Campione N 9 genotipo 3a 83 risultati quantitativi 500 0

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35 HCV RNA valore medio tutti i metodi: 729 (carica virale insufficiente: 10,3%) Genotipo HCV RNA Campione 2 Anno risposte LiPA RT-PCR sequenziamento altro tot genotipo 1a genotipo 1a/1b 1 1 genotipo genotipo 1b 2 2 carica virale insuff %

36 HCV RNA valore medio tutti i metodi: 2091 (carica virale insufficiente: 3.8%) Genotipo HCV RNA 45 Campione 4 40 Anno risposte LiPA RT-PCR sequenziamento altro tot genotipo 1a genotipo 1a/1b genotipo genotipo 1b 1 1 carica virale insuff %

37 HCV RNA valore medio tutti i metodi: 1533 (carica virale insufficiente: 4.8%) Genotipo HCV RNA 55 Campione 5 50 Anno risposte LiPA RT-PCR sequenziamento altro tot genotipo 1a genotipo 1a/1b 1 1 genotipo genotipo 1b carica virale insuff %

38 HCV RNA valore medio tutti i metodi: 480 (carica virale insufficiente: 20,7%) Genotipo HCV RNA 45 Campione 6 Anno risposte LiPA RT-PCR sequenziamento altro tot genotipo 4/4a-c-d genotipo 3a 1 1 genotipo genotipo 1a 2 2 carica virale insuff %

39 HCV RNA valore medio tutti i metodi: 84 (carica virale insufficiente: 40%) Genotipo HCV RNA 35 Campione 7 Anno risposte LiPA RT-PCR sequenziamento altro tot genotipo 1a genotipo 1a/1b genotipo genotipo 1b carica virale insuff %

40 HCV RNA valore medio tutti i metodi: 342 (carica virale insufficiente: 18%) Genotipo HCV RNA Campione 9 Anno risposte LiPA RT-PCR sequenziamento altro tot genotipo 3 /3a genotipo 1b 1 1 carica virale insuff %

41 VEQ 2014: HBV DNA

42 UI/ml HBV DNA Campione N 3 anno risultati quantitativi

43 UI/ml HBV DNA Campione N 4 anno risultati quantitativi

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45 UI/ml HBV DNA Campione N 5 anno risultati quantitativi

46 UI/ml HBV DNA Campione N 7 anno risultati quantitativi

47 UI/ml HBV DNA Campione N 8 anno risultati quantitativi

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52 UI/ml HBV DNA Campione N 9 anno risultati quantitativi

53 Alla ricerca di una risposta valida i risultati positivi sono falsi? i risultati negativi sono da attribuire ad una mancata capacità di rilevazione??

54 HBV DNA: minima concentrazione misurabile Abbott HBV PCR Real Time Qiagen HBV Reagent PCR kit Artus HBV RG PCR kit Roche Cobas Taqman 48 Roche Cobas Ampliprep Taqman HBV Siemens Versant HBV kpcr Genedia HBV Siemens Versant bdna Chiron dhbv Ultrio Plus Roche HBV PCR TaqScreen 10 UI/ml 10 UI/ml 5 UI/ml 6 UI/ml 20 UI/ml 13 UI/ml 100 UI/ml 357 UI/ml Probabilità di rilevamento (limiti fiduciali 95%) 2.5 ( ) UI/ml 2.3 ( ) UI/ml

55 HBV: i marcatori sierologici Campione VEQ biol mol 6 HBsAg Negativo anti HBs Negativo anti HBc Positivo Campione VEQ biol mol 9 HBsAg Negativo anti HBs Positivo anti HBc Positivo

56 HBV epatite B 2 miliardi di persone infette nel mondo 400 milioni portatore cronici nel mondo 4 milioni di nuovi casi /anno portatori cronici in Italia è la principale causa di epatocarcinoma Virus a DNA che si replica come un retrovirus Alto tasso di mutazione 10-5 sostituzioni/base/ciclo Elevato tasso di replicazione virale: per giorno Difficile da eradicare cccdna

57 HBV epatite B: rischi e conseguenze rischio di evoluzione della malattia rischio di trasmissione

58 HBV DNA: bassa viremia e rischio residuo Un caso della pratica quotidiana

59 Validazione biologica degli emocomponenti ALGORITMO DIAGNOSTICA MOLECOLARE VALIDAZIONE ESAMI Tri-NAT NEGATIVO* HBV DNA; HCV RNA; HIV RNA Tri-NAT REATTIVO* HBV DNA; HCV RNA; HIV RNA NEGATIVO** Esecuzione Test DISCRIMINATORIO su medesimo prelievo REATTIVO* NEGATIVO* referto su JCRS REATTIVI PER UNO DEI TRE MARCATORI POSITIVO* Eseguire Anti HBc Totale Valore test **Esito su JCRS Tavolo tecnico CQB Regione Toscana CRS Delibera 776 del 28/07/2015 HBV DNA REATTIVO** ALMENO 1 REATTIVA 20 REPLICHE dhbv - NAT Su sacca di Plasma TUTTE NEGATIVE HBV DNA- Inizialmente Reattivo NON DISCRIMINATO HIV E HCV NEGATIVI ** NEGATIVO* HBV DNA-HIV RNA-HCV RNA Inizialmente Reattivo NON DISCRIMINATO **

60 Donazione Castelfiorentino del 10/06/2015 CQB Area Vasta Centro AOU Careggi

61 Donazione Castelfiorentino del 10/06/2015 Sierologia screening HBsAg-HCVAb-HIV1-2 Ag/Ab-Lue Ab Tritest NAT (HIV1-HCV-HBV) Negativo Reattivo CQB Area Vasta Centro AOU Careggi

62 Donazione Castelfiorentino del 10/06/2015 Sierologia screening HBsAg-HCVAb-HIV1-2 Ag/Ab-Lue Ab Tritest NAT (HIV1-HCV-HBV) Negativo Reattivo Esecuzione test NAT discriminatorio sul prelievo della donazione HCV RNA Negativo HIV RNA Negativo HBV DNA Negativo CQB Area Vasta Centro AOU Careggi

63 Donazione Castelfiorentino del 10/06/2015 Sierologia screening HBsAg-HCVAb-HIV1-2 Ag/Ab-Lue Ab Tritest NAT (HIV1-HCV-HBV) Negativo Reattivo Esecuzione test NAT discriminatorio sul prelievo della donazione HCV RNA Negativo HIV RNA Negativo HBV DNA Negativo Esecuzione Markers HBV (HBsAg anti HBs anti HBc Negativo) Positivo Positivo CQB Area Vasta Centro AOU Careggi

64 Donazione Castelfiorentino del 10/06/2015 Sierologia screening HBsAg-HCVAb-HIV1-2 Ag/Ab-Lue Ab Tritest NAT (HIV1-HCV-HBV) Negativo Reattivo Esecuzione test NAT discriminatorio sul prelievo della donazione HCV RNA Negativo HIV RNA Negativo HBV DNA Negativo Esecuzione Markers HBV (HBsAg anti HBs anti HBc Negativo) Positivo Positivo Esecuzione test NAT discriminatorio su sacca di plasma su 20 repliche HCV RNA Negativo HIV RNA Negativo HBV DNA Reattivo 5 volte su 20 CQB Area Vasta Centro AOU Careggi

65 Donazione Castelfiorentino del 10/06/2015 Sierologia screening HBsAg-HCVAb-HIV1-2 Ag/Ab-Lue Ab Tritest NAT (HIV1-HCV-HBV) Negativo Reattivo Esecuzione test NAT discriminatorio sul prelievo della donazione HCV RNA Negativo HIV RNA Negativo HBV DNA Negativo Esecuzione Markers HBV (HBsAg anti HBs anti HBc Negativo) Positivo Positivo Esecuzione test NAT discriminatorio su sacca di plasma su 20 repliche HCV RNA Negativo HIV RNA Negativo HBV DNA Reattivo 5 volte su 20 Validazione della donazione come HBV DNA Reattivo CQB Area Vasta Centro AOU Careggi

66 Record azzurro nel salto in alto: Tamberi vola a 2.37 e sogna Pechino Il 23enne marchigiano si colloca al terzo posto delle liste mondiali stagionali e al primo di quelle europee