1 Finalità d uso. 5 Stabilità e modalità di conservazione. 2 Principio del test. 6 Materiali e strumenti addizionali richiesti e non forniti
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- Rita Carnevale
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1 MYCHLE v.3 1 Finalità d uso RealCycler MYCHLE è un kit di reagenti che permette la rilevazione qualitativa per Real-time PCR del DNA di Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae spp. in campioni clinici, utilizzando lo SmartCycler (Cepheid ). Il sistema include un controllo interno CHIC (Competitive Heterologous Internal Control) per la prevenzione dei falsi negativi dovuti all inibizione della reazione. 2 Principio del test La reazione a catena della polimerasi (PCR) si basa sull amplificazione di una regione specifica di DNA/RNA, mediante l utilizzo di primers complementari alla sequenza bersaglio. Nella Real-time PCR si utilizzano sonde marcate con fluorofori, che emettono fluorescenza a seguito della reazione di amplificazione. Il ciclo della PCR in cui si evidenzia una fluorescenza significativa è proporzionale alla quantità di DNA/RNA presente nel campione. Questo valore è definito il Ciclo soglia (Ct -Cycle Treshold- o Cq - Cycle Quantification-). L amplificazione di Mycoplasma pneumoniae viene rilevata in corrispondenza del canale del fluoroforo FAM, CHIC viene rilevato in corrispondenza del fluoroforo Alx532, Chlamydophila pneumoniae in corrispondenza del fluoroforo TxR spp. in corrispondenza del fluoroforo Alx Specifiche tecniche Sensibilità Mycoplasma pneumoniae: 100 copie/µl. Chlamydophila pneumoniae: 100 copie/µl. Legionella spp.: 100 copie/µl. La sensibilità analitica è stata calcolata sulla base di diluizioni successive. La sensibilità è stata determinata in prove ripetute, mostrando una riproducibilità di oltre il 95%. Specificità Mycoplasma pneumoniae: gene P1. Chlamydophila pneumoniae: gene DNA-directed RNA polymerase beta chain. Legionella spp.: 23S-5S ribosomal RNA. La validazione della specificità è stata eseguita in accordo alle prove sperimentali e all analisi BLAST ( Queste specifiche sono state verificate utilizzando il pannello QCMD 2012 e M. pneumoniae e il pannello QCMD 2011 Legionella spp.. 4 Contenuti RealCycler MYCHLE include la miscela AmpliMix dispensata nei tubi di reazione ed un Controllo Positivo DNA MYCHLE, costituito da una miscela di DNA di Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae spp.. Tutti i reagenti sono pronti all uso e non necessitano ne l aggiunta ne la ricostituzione di nessun componente. Componenti Flaconi Volume AmpliMix 24 18,67 μl Controllo Positivo 1 60 μl 5 Stabilità e modalità di conservazione Tutti i componenti di RealCycler MYCHLE devono essere stoccati a -20 C. Il kit è stabile a -20 C fino alla scadenza indicata sull etichetta esterna del kit. 6 Materiali e strumenti addizionali richiesti e non forniti - Sistema di PCR Real-time SmartCycler (Cepheid ). - Microcentrifuga per i tubi dello SmartCycler. - Rack per i tubi di reazione SmartCycler. - Kit di purificazione del DNA. - Guanti monouso. - Pipette calibrate. - Puntali per pipette con filtro. - Freezer (-20 C). - Controllo negativo (DNA di campioni negativi, acqua o tampone d eluzione). 7 Avvertenze e precauzioni - Tutti i componenti del kit devono essere mantenuti al freddo mentre vengono manipolati. - Dopo l aggiunta del DNA si deve ridurre il tempo necessario per iniziare il programma di amplificazione. - Non esporre i tubi di reazione contenenti la mix di amplificazione alla luce per lungo tempo. - Ripetuti cicli di congelamento/scongelamento possono ridurre la sensibilità del kit. - Utilizzare guanti monouso. - Utilizzare pipette adeguate calibrate e puntali per pipette con filtro. - Gli studi devono essere fatti da personale qualificato e seguendo le buone pratiche di laboratorio. - Si raccomanda di includere un controllo positivo ed uno negativo ogni volta che si fanno le analisi. - Si raccomanda di portare a temperatura ambiente le provette per 5 minuti prima di aprirle. Altrimenti si può rompere il tappo. - Non utilizzare il kit oltre la data di scadenza. - La presenza di polimorfismi nelle sequenze di unione delle sonde o degli oligonucleotidi di RNA/DNA degli agenti patogeni possono generare risultati erronei. In caso di discordanza tra osservazione clinica e i risultati ottenuti si consiglia di verificare i risultati con un metodo alternativo. - I risultati ottenuti con questo kit diagnostico devono essere interpretati nel contesto di un quadro clinico generale e non possono essere l'unico criterio nel processo decisionale clinico. - Per uso diagnostico in vitro. Il marchio CE non include la ricerca di Chlamydophila pneumoniae. I risultati ottenuti con questo kit per questo patogeno devono essere considerati solo per scopi di ricerca scientifica. 1 RealCycler MYCHLE v.3 2
2 - Cepheid e SmartCycler sono marchi registrati di Cepheid Corporation. - QIAamp è un marchio registrato del QIAGEN Group. - Maxwell è un marchio registrato di Promega Corporation. - NucliSENS easymag è un marchio registrato di biomérieux. 8 Campioni clinici - Prelevare i campioni clinici in appositi contenitori sterili. - Mantenere e trasportare i campioni congelati a -20 C fino all uso. - Il kit è compatibile con qualsiasi campione nel quale il patogeno sia presente e si riesca a estrarre un DNA di qualità. Campioni clinici validati: Mycoplasma pneumoniae: coltura, essudato, lavaggio broncoalveolare e mezzo di transporto di campioni (STM). Chlamydophila pneumoniae: coltura, lavaggio broncoalveolare e mezzo di transporto di campioni (STM). Legionella spp.: lavaggio broncoalveolare e mezzo di transporto di campioni (STM). 9 Procedura c) Preparazione della reazione - Scongelare i tubi contenenti l AmpliMix necessari alla reazione di amplificazione dei campioni e il Controllo Positivo. Utilizare come controllo negativo DNA di campioni negativi, acqua o tampone d eluzione di DNA (non forniti). - Aggiungere 8 μl di DNA di ogni campione o controllo in ogni tubo. - Spinnare i tubi perché la reazione ci sia nella zona ottica del tubo. Verificare l assenza di bolle in tale area. - Caricare i tubi nello strumento. - Create Run > Dye Set > FATA25. - Add/Remove Sites: assegnare il protocollo MYCHLE alle posizioni corrispondenti ai campioni e ai controlli. - Start Run: Avviare il programma di amplificazione. d) Regolare la soglia di fluorescenza - Analysis settings > Manual Thresh Fluor Units > fissare il valore a e) Interpretazione del risultato dei controlli - Risultati validi dei controlli a) Purificazione degli acidi nucleici Il DNA deve essere purificato dai campioni clinici utilizzando una procedura adeguata. Sono disponibili in commercio numerosi kit di purificazione di acidi nucleici. Si prega di eseguire il processo di purificazione in accordo alle istruzioni del produttore a partire dal volume di campione raccommandato. Sistema di purificazione validato: QIAamp DNA Blood Mini Kit (reference 51104, 51106). QIAGEN. Controlli Canali Ch1 Ch2 Ch3 Ch4 FAM ( ) Alx532 CHIC Indifferente ( ) TxR ( ) Alx647 ( ) Interpr. VALIDO VALIDO Sistemi di purificazione compatibili: Maxwell 16 Cell LEV DNA Purification kit. Promega Corporation. BioRobot EZ1. QIAGEN. QIAcube. QIAGEN. NucliSENS easymag. biomérieux. b) Protocollo Impostare il protocollo di amplificazione MYCHLE in accordo con le seguenti specificazioni: - Risultati invalidi dei controlli In caso di ottenere in alcun canale del Controllo Positivo (eccetto CHIC) un risultato negativo o un Ct fuori indicato sull etichetta interna si considera il controllo invalido. I risultati ottenuti nei campioni inclusi nella serie di lavoro devono essere scartati (non valutabili). In caso di ottenere in alcun canale del controllo negativo (eccetto CHIC) un valore de Ct > 0, i risultati ottenuti nei campioni inclusi nella serie di lavoro devono essere scartati (non valutabili). 3 RealCycler MYCHLE v.3 4
3 f) Interpretazione dei risultati dei campioni Interpretare il risultato ottenuto in ogni campioni o controllo secondo la combinazione dei segnali indicati nella tabella seguente: Canali Ch1 Ch2 Ch3 Ch4 FAM Alx532 CHIC TxR Alx647 Indifferente Interpretazione M. pneumoniae Indifferente Indifferente Indifferente Indifferente Indifferente Indifferente Legionella M. pneumoniae e M. pneumoniae M. pneumoniae, Figura 2 (Canale Alx532: CHIC): Risultati ottenuti dall amplificazione di un controllo negativo e di un controllo positivo. Controllo negativo (A1 blu): si osserva segnale Ct=35,08. Controllo positivo (A2 grigio): si osserva segnale Ct=35,74. NON SI RILEVA Ct fuori NON VALUTABILE 0,00 NON VALUTABILE Figura 3 (Canale TxR: ): Risultati ottenuti grigio): si osserva segnale Ct=31,60. g) Esempio di un risultato Figura 1 (Canale FAM: M. pneumoniae): Risultati ottenuti grigio): si osserva segnale Ct=31,56. Figura 4 (Canale Alx647: Legionella spp.): Risultati ottenuti grigio): si osserva segnale Ct=27,58. 5 RealCycler MYCHLE v.3 6
4 10 Interpretazione dei risultati utilizzando l'applicazione informatica Visor RealCycler a) Esportazione dei risultati a.1) Dallo strumento SmartCycler Dx - Export > si apre la finestra Export data > Export (lasciare l'opzione predefinita Export Optics Data, Export Results Tables ed Export Assay Settings). b) Preparazione Visor RealCycler - Aprire il Visor RealCycler e introdurre lo username e la password. - Selezionare lo strumento utilizato > Options > Setup. - Data > Lot input > selezionare l AmpliMix MYCHLE. - Introdurre il valore del lotto indicado indicata sull etichetta esterna del kit RealCycler MYCHLE. - Introdurre e i valori di Ct per ciascun canale indicati sull etichetta interna del kit RealCycler MYCHLE (ignorare il segno < ) > salvare ed uscire. - Colonna AmpliMix > distribuire il tasto destro del mouse e selezionare l AmpliMix MYCHLE. Gli agenti patogeni rilevati in ciascun canale vengono visualizzati automaticamente. - Colonna Lot > selezionare il lotto dell AmpliMix. c) Importazione dei risultati - Save (eventualmente modificare il nome del file). - Data > Import Run Data > selezionare il file CSV. - Selezionare Use Preanalytical Data from SmartCycler (questa opzione cancellerà i dati dei campioni inseriti nel Visor) oppure Use Preanalytical Data from Visor (questa opzione non importerà l'identificazione dei campioni dello SmartCycler ). - Import data. - Nella colonna Sample identificare i controlli e e opzionalmente i campioni della serie. d) Generare un report - File > Reports > Selezionare i campioni che si vogliono stampare. a.2) Dallo strumento SmartCycler I+D - Export > si apre la finestra Export data > Export (lasciare l'opzione predefinita Export Optics Data et Export Results Table and Analysis Settings). e) Interpretazione dei risultati - Rilevamento dei patogeni L applicazione informatica Visor RealCycler indica il canale sul quale si rileva o no segnale. Nei controlli e nei campioni i segnali possono essere validi (VAL) o invalidi (INV). In CHIC il segnale poú essere VAL ( nei campioni negativi) o VAL* (Ct indifferente nei campioni positiv). Se si ottiene segnale si considera positivo per questo patogeno sempre e quando lo status del campione sia valido. - Save (eventualmente modificare il nome del file). 7 RealCycler MYCHLE v.3 8
5 - Status del campione STATUS Interpretazione CHIC Controllo Positivo Controllo Negativo VALIDO Ct=0 Ct=0 Ct fuori Se le curve che superano la soglia sono anormali (no sigmoidee) o lineale, non sono idonee per l'analisi ed i risultati di questi campioni devono essere scartati. Il Visor RealCycler esegue un'analisi per il loro rilevamento, nel qual caso le classifica come invalide. Tuttavia, l'utente deve valutare singolarmente se le curve sono adatte per l'analisi, ed scartare quelli che hanno una forma anomala (non sigmoide) o lineari. 11 Controllo qualità Per validare i risultati, i valori di Ct ottenuti per il controllo positivo e per il controllo interno devono rientrare entro specifici range contenuti sull etichetta interna del kit. Ciascun lotto di RealCycler MYCHLE è stato testato in accordo alle specifiche del metodo Real-time PCR utilizzando lo strumento SmartCycler (Cepheid ). Data di pubblicazione: Giugno, Progenie Molecular Edificio Progenie. Valle de la Ballestera Spain T: F: RealCycler MYCHLE v.3 10
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