1 Finalità d uso. 4 Contenuti. 2 Principio del test. 5 Stabilità e modalità di conservazione
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- Orazio Palmisano
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1 HERPLX v.2 1 Finalità d uso RealCycler HERPLX è un kit di reagenti che permette la rilevazione qualitativa per Real-time PCR del DNA di Herpesvirus tipo 1 (HSV1), Herpesvirus tipo 2 (HSV2), virus Varicella-Zoster (VZV), virus di Epstein-Barr (EBV), Cytomegalovirus (CMV) ed Herpesvirus tipo 6 (HHV6) in campioni clinici, utilizzando lo SmartCycler (Cepheid ). Il sistema include un controllo interno (Competitive Heterologous Internal Control) per la prevenzione dei falsi negativi dovuti all inibizione della reazione. 4 Contenuti RealCycler HERPLX include le miscele AmpliMix HSVTVA e AmpliMix EBCMVI dispensate nei tubi di reazione, un Controllo Positivo DNA HSVTVA, costituito da una miscela di DNA di Herpesvirus tipo 1, Herpesvirus tipo 2 e il virus Varicella-Zoster e un Controllo Positivo DNA EBCMVI, costituito da una miscela di DNA del virus di Epstein-Barr, Cytomegalovirus ed Herpesvirus tipo 6. Tutti i reagenti sono pronti all uso e non necessitano ne l aggiunta ne la ricostituzione di nessun componente. 2 Principio del test La reazione a catena della polimerasi (PCR) si basa sull amplificazione di una regione specifica di DNA/RNA, mediante l utilizzo di primers complementari alla sequenza bersaglio. Nella Real-time PCR si utilizzano sonde marcate con fluorofori, che emettono fluorescenza a seguito della reazione di amplificazione. Il ciclo della PCR in cui si evidenzia una fluorescenza significativa è proporzionale alla quantità di DNA/RNA presente nel campione. Questo valore è definito il Ciclo soglia (Ct -Cycle Treshold- o Cq - Cycle Quantification-). Nell amplificazione di HSVTVA, Herpesvirus tipo 1 viene rilevato in corrispondenza del canale del fluoroforo, viene rilevato in corrispondenza del fluoroforo, Herpesvirus tipo 2 in corrispondenza del fluoroforo e il virus Varicella-Zoster in corrispondenza del fluoroforo. Nell amplificazione di EBCMVI, il virus di Epstein-Barr viene rilevato in corrispondenza del canale del fluoroforo, viene rilevato in corrispondenza del fluoroforo, Cytomegalovirus in corrispondenza del fluoroforo ed Herpesvirus tipo 6 in corrispondenza del fluoroforo. 3 Specifiche tecniche Sensibilità Herpesvirus tipo 1: 10 copie/µl. Herpesvirus tipo 2: 100 copie/µl. Virus Varicella-Zoster: 100 copie/µl. Virus di Epstein-Barr: 10 copie/µl. Cytomegalovirus: 10 copie/µl. Herpesvirus tipo 6: 10 copie/µl. La sensibilità analitica è stata calcolata sulla base di diluizioni successive. La sensibilità è stata determinata in prove ripetute, mostrando una riproducibilità di oltre il 95%. Specificità Herpesvirus tipo 1: gene US6. Herpesvirus tipo 2: gene DNA polimerase. Virus Varicella-Zoster: gene Single-stranded DNA-binding protein (ORF 29). Virus di Epstein-Barr: gene LMP1. Cytomegalovirus: gene Glicoproteina B. Herpesvirus tipo 6: gene U67. La validazione della specificità è stata eseguita in accordo alle prove sperimentali e all analisi BLAST ( Componenti Flaconi Volume AmpliMix HSVTVA 12 18,67 µl AmpliMix EBCMVI 12 18,67 µl Controllo Positivo DNA HSVTVA Controllo Positivo DNA EBCMVI 1 30 µl 1 30 µl 5 Stabilità e modalità di conservazione Tutti i componenti di RealCycler HERPLX devono essere stoccati a -20 C. Il kit è stabile a -20 C fino alla scadenza indicata sull etichetta esterna del kit. 6 Materiali e strumenti addizionali richiesti e non forniti - Sistema di PCR Real-time SmartCycler (Cepheid ). - Microcentrifuga per i tubi dello SmartCycler. - Rack per i tubi di reazione SmartCycler. - Kit di purificazione del DNA. - Guanti monouso. - Pipette calibrate. - Puntali per pipette con filtro. - Freezer (-20 C). - Controllo negativo (DNA di campioni negativi, acqua o tampone d eluzione). 7 Avvertenze e precauzioni - Tutti i componenti del kit devono essere mantenuti al freddo mentre vengono manipolati. - Dopo l aggiunta del DNA si deve ridurre il tempo necessario per iniziare il programma di amplificazione. - Non esporre i tubi di reazione contenenti la mix di amplificazione alla luce per lungo tempo. - Ripetuti cicli di congelamento/scongelamento possono ridurre la sensibilità del kit. - Utilizzare guanti monouso. - Utilizzare pipette adeguate calibrate e puntali per pipette con filtro. - Gli studi devono essere fatti da personale qualificato e seguendo le buone pratiche di laboratorio. 1 RealCycler HERPLX v.2 2
2 - Si raccomanda di includere un controllo positivo ed uno negativo ogni volta che si fanno le analisi. - Si raccomanda di portare a temperatura ambiente le provette per 5 minuti prima di aprirle. Altrimenti si può rompere il tappo. - Non utilizzare il kit oltre la data di scadenza. - La presenza di polimorfismi nelle sequenze di unione delle sonde o degli oligonucleotidi di RNA/DNA degli agenti patogeni possono generare risultati erronei. In caso di discordanza tra osservazione clinica e i risultati ottenuti si consiglia di verificare i risultati con un metodo alternativo. - I risultati ottenuti con questo kit diagnostico devono essere interpretati nel contesto di un quadro clinico generale e non possono essere l'unico criterio nel processo decisionale clinico. - Per uso diagnostico in vitro. - Cepheid e SmartCycler sono marchi registrati di Cepheid Corporation. - QIAamp è un marchio registrato del QIAGEN Group. - Maxwell è un marchio registrato di Promega Corporation. - NucliSENS easymag è un marchio registrato di biomérieux. Sistemi di purificazione compatibili: Maxwell 16 Viral Total Purification kit. Promega Corporation. BioRobot EZ1. QIAGEN. QIAcube. QIAGEN. NucliSENS easymag. biomérieux. Procedura HSVTVA (tubo verde) b) Protocollo Impostare il protocollo di amplificazione HSVTVA in accordo con le seguenti specificazioni: 8 Campioni clinici - Prelevare i campioni clinici in appositi contenitori sterili. - Mantenere e trasportare i campioni congelati a -20 C fino all uso. - Il kit è compatibile con qualsiasi campione nel quale il patogeno sia presente e si riesca a estrarre un DNA di qualità. Campioni clinici validati: Herpesvirus tipo 1: essudato, mezzo di transporto di virus (VTM), campione genitale e tessuto parafinato. Herpesvirus tipo 2: essudato, mezzo di transporto di virus (VTM), campione genitale e tessuto parafinato. Virus Varicella-Zoster: coltura, liquido cerebrospinale e mezzo di transporto di virus (VTM), Virus di Epstein-Barr: biopsia di colon, biopsia di esofago, coltura, lavaggio broncoalveolare, liquido cerebrospinale, mezzo di transporto di virus (VTM), linfonodo, plasma, sangue, siero e ulcera di esofago. Cytomegalovirus: biopsia di colon, biopsia epatica, biopsia intestinale, coltura, essudato, umore, lavaggio broncoalveolare, liquido cerebrospinale, orina, plasma, sangue e siero. Herpesvirus tipo 6: biopsia, coltura, mezzo di transporto di virus (VTM), plasma e sangue. 9 Procedura a) Purificazione degli acidi nucleici Il DNA deve essere purificato dai campioni clinici utilizzando una procedura adeguata. Sono disponibili in commercio numerosi kit di purificazione di acidi nucleici. Si prega di eseguire il processo di purificazione in accordo alle istruzioni del produttore a partire dal volume di campione raccommandato. Sistema di purificazione validato: QIAamp DNA Blood Mini Kit (reference 51104, 51106). QIAGEN. c) Preparazione della reazione - Scongelare i tubi contenenti l AmpliMix HSVTVA necessari alla reazione di amplificazione dei campioni e il Controllo Positivo. Utilizare come controllo negativo DNA di campioni negativi, acqua o tampone d eluzione di DNA (non forniti). - Aggiungere 8 µl di DNA di ogni campione o controllo in ogni tubo. - Spinnare i tubi perché la reazione ci sia nella zona ottica del tubo. Verificare l assenza di bolle in tale area. - Caricare i tubi nello strumento. - Create Run > Dye Set > FATA25. - Add/Remove Sites: assegnare il protocollo HSVTVA alle posizioni corrispondenti ai campioni e ai controlli. - Start Run: Avviare il programma di amplificazione. d) Regolare la soglia di fluorescenza - Analysis settings > Manual Thresh Fluor Units > fissare il valore a e) Interpretazione del risultato dei controlli - Risultati validi dei controlli Controlli ( ) Indifferente ( ) ( ) ( ) Interpr. VALIDO VALIDO 3 RealCycler HERPLX v.2 4
3 - Risultati invalidi dei controlli g) Esempio di un risultato In caso di ottenere in alcun canale del Controllo Positivo (eccetto ) un risultato negativo o un Ct fuori indicato sull etichetta interna si considera il controllo invalido. I risultati ottenuti nei campioni inclusi nella serie di lavoro devono essere scartati (non valutabili). In caso di ottenere in alcun canale del controllo negativo (eccetto ) un valore de Ct > 0, i risultati ottenuti nei campioni inclusi nella serie di lavoro devono essere scartati (non valutabili). f) Interpretazione dei risultati dei campioni Interpretare il risultato ottenuto in ogni campioni o controllo secondo la combinazione dei segnali indicati nella tabella seguente: Interpretazione Figura 1 (Canale : HSV1): Risultati ottenuti dall amplificazione di un controllo negativo, di un controllo positivo HSV1, di un controllo blu): non rilevato. Controllo positivo HSV1 (A10 grigio): si osserva segnale Ct=30,76. Control positivo HSV2 (A11 arancione): non rilevato. Controllo positivo VZV (A12 verde): non rilevato. Indifferente Indifferente Indifferente Indifferente Indifferente HSV1 HSV2 VZV HSV1 e HSV2 HSV1 e VZV Indifferente Indifferente HSV2 e VZV HSV1, HSV2 e VZV NON SI RILEVA Figura 2 (Canale : ): Risultati ottenuti dall amplificazione di un controllo negativo, di un controllo positivo HSV1, di un controllo blu): si osserva segnale Ct=27,47. Controllo positivo HSV1 (A10 grigio): si osserva segnale Ct=27,78. Control positivo HSV2 (A11 arancione): si osserva segnale Ct=28,15. Controllo positivo VZV (A12 verde): si osserva segnale Ct=27,94. Ct fuori NON VALUTABILE 0,00 NON VALUTABILE Figura 3 (Canale : HSV2): Risultati ottenuti dall amplificazione di un controllo negativo, di un controllo positivo HSV1, di un controllo blu): non rilevato. Controllo positivo HSV1 (A10 grigio): non rilevato. Control positivo HSV2 (A11 arancione): si osserva segnale Ct=28,36. Controllo positivo VZV (A12 verde): non rilevato. 5 RealCycler HERPLX v.2 6
4 e) Interpretazione del risultato dei controlli - Risultati validi dei controlli Figura 4 (Canale : VZV): Risultati ottenuti dall amplificazione di un controllo negativo, di un controllo positivo HSV1, di un controllo blu): non rilevato. Controllo positivo HSV1 (A10 grigio): non rilevato. Control positivo HSV2 (A11 arancione): non rilevato. Controllo positivo VZV (A12 verde): si osserva segnale Ct=30,91. Procedura EBCMVI b) Protocollo Impostare il protocollo di amplificazione EBCMVI in accordo con le seguenti specificazioni: Controlli ( Indifferente ) ( ) - Risultati invalidi dei controlli ( ) ( ) Interpr. VALIDO VALIDO In caso di ottenere in alcun canale del Controllo Positivo (eccetto ) un risultato negativo o un Ct fuori indicato sull etichetta interna si considera il controllo invalido. I risultati ottenuti nei campioni inclusi nella serie di lavoro devono essere scartati (non valutabili). In caso di ottenere in alcun canale del controllo negativo (eccetto ) un valore de Ct > 0, i risultati ottenuti nei campioni inclusi nella serie di lavoro devono essere scartati (non valutabili). f) Interpretazione dei risultati dei campioni Interpretare il risultato ottenuto in ogni campioni o controllo secondo la combinazione dei segnali indicati nella tabella seguente: c) Preparazione della reazione - Scongelare i tubi contenenti l AmpliMix EBCMVI necessari alla reazione di amplificazione dei campioni e il Controllo Positivo. Utilizare come controllo negativo DNA di campioni negativi, acqua o tampone d eluzione di DNA (non forniti). - Aggiungere 8 µl di DNA di ogni campione o controllo in ogni tubo. - Spinnare i tubi perché la reazione ci sia nella zona ottica del tubo. Verificare l assenza di bolle in tale area. - Caricare i tubi nello strumento. - Create Run > Dye Set > FATA25. - Add/Remove Sites: assegnare il protocollo EBCMVI alle posizioni corrispondenti ai campioni e ai controlli. - Start Run: Avviare il programma di amplificazione. Indifferente Indifferente Indifferente Indifferente Indifferente Indifferente Interpretazione EBV CMV HHV6 EBV e CMV EBV e HHV6 CMV e HHV6 d) Regolare la soglia di fluorescenza Indifferente EBV, CMV e HHV6 - Analysis settings > Manual Thresh Fluor Units > fissare il valore a NON SI RILEVA Ct fuori NON VALUTABILE 0,00 NON VALUTABILE 7 RealCycler HERPLX v.2 8
5 g) Esempio di un risultato Figura 1 (Canale : EBV): Risultati ottenuti dall amplificazione di un controllo negativo, di un controllo positivo EBV, di un controllo blu): non rilevato. Controllo positivo EBV (A10 grigio): si osserva segnale Ct=30,74. Controllo positivo CMV (A11 arancione): non rilevato. Controllo positivo HHV6 (A12 verde): non rilevato. Figura 4 (Canale : HHV6): Risultati ottenuti dall amplificazione di un controllo negativo, di un controllo positivo EBV, di un controllo blu): non rilevato. Controllo positivo EBV (A10 grigio): non rilevato. Controllo positivo CMV (A11 arancione): non rilevato. Controllo positivo HHV6 (A12 verde): si osserva segnale Ct=34, Interpretazione dei risultati utilizzando l'applicazione informatica Visor RealCycler a) Esportazione dei risultati a.1) Dallo strumento SmartCycler Dx - Export > si apre la finestra Export data > Export (lasciare l'opzione predefinita Export Optics Data, Export Results Tables ed Export Assay Settings). Figura 2 (Canale : ): Risultati ottenuti dall amplificazione di un controllo negativo, di un controllo positivo EBV, di un controllo blu): si osserva segnale Ct=30,00. Controllo positivo EBV (A10 grigio): si osserva segnale Ct=29,87. Controllo positivo CMV (A11 arancione): si osserva segnale Ct=30,27. Controllo positivo HHV6 (A12 verde): si osserva segnale Ct=29,80. - Save (eventualmente modificare il nome del file). Figura 3 (Canale : CMV): Risultati ottenuti dall amplificazione di un controllo negativo, di un controllo positivo EBV, di un controllo blu): non rilevato. Controllo positivo EBV (A10 grigio): non rilevato. Controllo positivo CMV (A11 arancione): si osserva segnale Ct=34,18. Controllo positivo HHV6 (A12 verde): non rilevato. a.2) Dallo strumento SmartCycler I+D - Export > si apre la finestra Export data > Export (lasciare l'opzione predefinita Export Optics Data et Export Results Table and Analysis Settings). 9 RealCycler HERPLX v.2 10
6 e) Interpretazione dei risultati - Rilevamento dei patogeni - Save (eventualmente modificare il nome del file) L applicazione informatica Visor RealCycler indica il canale sul quale si rileva o no segnale. Nei controlli e nei campioni i segnali possono essere validi (VAL) o invalidi (INV). In il segnale poú essere VAL ( nei campioni negativi) o VAL* (Ct indifferente nei campioni positiv). Se si ottiene segnale si considera positivo per questo patogeno sempre e quando lo status del campione sia valido. - Status del campione STATUS Interpretazione Controllo Positivo Controllo Negativo VALIDO Ct=0 WARNING Ct=0 WARNING b) Preparazione Visor RealCycler - Aprire il Visor RealCycler e introdurre lo username e la password. - Selezionare lo strumento utilizato > Options > Setup. - Data > Lot input > selezionare l AmpliMix HSVTVA o l AmpliMix EBCMVI (a seconda dell AmpliMix utilizzata). - Introdurre il valore del lotto indicado indicata sull etichetta esterna del kit RealCycler HERPLX. - Introdurre e i valori di Ct per ciascun canale indicati sull etichetta interna del kit RealCycler HERPLX: AmpliMix HSVTVA o AmpliMix EBCMVI (ignorare il segno < ) > salvare ed uscire. - Colonna AmpliMix > distribuire il tasto destro del mouse e selezionare l AmpliMix HSVTVA o l AmpliMix EBCMVI. Gli agenti patogeni rilevati in ciascun canale vengono visualizzati automaticamente. - Colonna Lot > selezionare il lotto dell AmpliMix. c) Importazione dei risultati - Data > Import Run Data > selezionare il file CSV. - Selezionare Use Preanalytical Data from SmartCycler (questa opzione cancellerà i dati dei campioni inseriti nel Visor) oppure Use Preanalytical Data from Visor (questa opzione non importerà l'identificazione dei campioni dello SmartCycler ). - Import data. - Nella colonna Sample identificare i controlli e e opzionalmente i campioni della serie. d) Generare un report - File > Reports > Selezionare i campioni che si vogliono stampare. WARNING Ct fuori Se le curve che superano la soglia sono anormali (no sigmoidee) o lineale, non sono idonee per l'analisi ed i risultati di questi campioni devono essere scartati. Il Visor RealCycler esegue un'analisi per il loro rilevamento, nel qual caso le classifica come invalide. Tuttavia, l'utente deve valutare singolarmente se le curve sono adatte per l'analisi, ed scartare quelli che hanno una forma anomala (non sigmoide) o lineari. 11 Controllo qualità Per validare i risultati, i valori di Ct ottenuti per il controllo positivo e per il controllo interno devono rientrare entro specifici range contenuti sull etichetta interna del kit. Ciascun lotto di RealCycler HERPLX è stato testato in accordo alle specifiche del metodo Real-time PCR utilizzando lo strumento SmartCycler (Cepheid ). Data di pubblicazione: Giugno, Progenie Molecular Edificio Progenie. Valle de la Ballestera Spain T: F: RealCycler HERPLX v.2 12
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