DIAGNOSTICA ENZIMATICA

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1 DIAGNOSTICA ENZIMATICA

2 GLI ENZIMI SI DOSANO SU DIVERSI LIQUIDI BIOLOGICI: - PLASMA O SIERO - Altre matrici: URINE, SALIVA, ESSUDATI, ecc. I CONTESTI DIAGNOSTICI IN CUI SI USANO QUESTI DOSAGGI SONO DUE: 1. Valutazione attività di produzione dell enzima: malattie genetico-metaboliche con dell attività enzimatica (per es., fenilchetonuria, glicogenosi, ecc.) 2. Valutazione della quantità di enzima rilasciata dalle cellule nei liquidi biologici per iperproduzione o danno cellulare: dei valori (per es. infarto del miocardio, tumori, ecc.) Generalmente per misura di un enzima si intende la misura della sua attività enzimatica che si ottiene misurando la quantità di substrato che l enzima presente nel campione trasforma nel prodotto nell unità di tempo.

3 Enzimi con valore diagnostico I dosaggi enzimatici comunemente usati a scopo diagnostico sono numericamente limitati: solo una decina sono di impiego routinario e questi oggi costituiscono circa il 30% del carico di lavoro di un comune laboratorio diagnostico.

4 ENZIMI DI INTERESSE DIAGNOSTICO GLI ENZIMI PRESENTI NEL SANGUE POSSONO ESSERE CLASSIFICATI IN 1. ENZIMI SPECIFICI (esplicano direttamente nel plasma le loro attività biologiche; per es., quelli coinvolti nella coagulazione del sangue) 2. ENZIMI SECRETI O RIASSORBITI (svolgono la loro funzione nei liquidi organici, come avviene per gli enzimi delle ghiandole esocrine) 3. ENZIMI CELLULARI (che svolgono funzioni intracellulari e sono riversati nel sangue nel turnover cellulare)

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6 CARATTERISTICHE DEGLI ENZIMI usati a scopo diagnostico Gli aumenti o le diminuzioni di attività enzimatiche sieriche sono sempre correlati ad alterazioni della funzionalità cellulare

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11 ORGANI DIVERSI ESPRIMONO UN PATTERN ENZIMATICO DIVERSO Organi diversi hanno una diversa dotazione enzimatica (differenze metaboliche) Ci sono enzimi organo-specifici: glutammatodeidrogenasi (GLDH o GD) è l enzima organo-specifico del fegato, mentre la creatina chinasi (CK) lo è del muscolo

12 ISOENZIMI o ISOZIMI Proteine che catalizzano la stessa reazione, ma presentano diverse proprietà molecolari (struttura primaria, struttura quaternaria, carica elettrica, massa molecolare, parametri cinetici, ecc.). Aumentano il valore predittivo ed il ruolo diagnostico dell enzimologia

13 ORGANI DIVERSI ESPRIMONO ISOENZIMI DIVERSI Gli isoenzimi, o isozimi, sono forme multiple di un enzima che catalizzano la stessa reazione, ma differiscono nella struttura o nella composizione in subunità. Ad esempio, la lattato deidrogenasi (LDH) è una proteina tetramerica costituita da due differenti catene polipeptidiche, M ed H. Dalle diverse combinazioni delle due catene si hanno cinque isoenzimi: M4, M3H, M2H2, MH3, H4. La creatinachinasi (CK) è una proteina dimerica costituita da due differenti catene polipeptidiche, B e M. Dalle diverse combinazioni di queste due catene si hanno tre isoenzimi: BB, BM e MM. Hanno caratteristiche fisiche (i.e., massa), chimiche (i.e., composizione, pi) e biochimiche (ph ottimale, costanti catalitiche (Km, Vmax)) diverse, e sono pertanto discriminabili con tecniche analitiche specifiche. Sono presenti in tessuti diversi. Per es., la M4 è prevalentemente espressa nel muscolo scheletrico, mentre la forma H4 è presente solo nel miocardio. Altro esempio, la fosfatasi acida è presente nella prostata, la fosfatasi alcalina è presente nel fegato e nelle ossa. Poiché gli isoenzimi sono distribuiti in maniera differente nei vari organi, l'analisi quantitativa di questi consente di risalire all'organo bersaglio della patologia. Dunque livelli alterati di questi sono indici specifici di alcune malattie come quelle cardiache, muscolari, ossee, etc., per questo sono di grande utilità diagnostica.

14 ISOENZIMI DELLA CK

15 Creatina chinasi (CK)

16 Lattato deidrogenasi (LDH)

17 FOSFATASI ALCALINA (ALP) La ALP è presente soprattutto nel fegato (canalicoli biliari) e nelle ossa (osteoblasti), placenta e rene. La ALP aumenta nelle: Affezioni del sistema epato-biliare (poco in cirrosi, epatite); Alterazioni della sostanza ossea (rachitismo, metastasi ossee, Morbo di Paget); Iperparatiroidismo Patologie infiammatorie croniche intestinali

18 Utilità diagnostica della misura dell attività della ALP nel sangue Un aumento elevato (5 volte superiore ai valori di riferimento) può essere dovuto a situazioni come: cirrosi biliare ostruzione delle vie biliari morbo di Paget altre patologie Un aumento moderato (3-5 volte superiore ai valori di riferimento) può essere dovuto a situazioni come: epatopatie mononucleosi infettiva altre patologie Un aumento lieve (fino a 3 volte superiore ai valori di riferimento) può essere dovuto a situazioni come: epatite virale fratture gravidanza Una diminuzione può essere dovuta a situazioni come: ipotiroidismo scorbuto cachessia anemie

19 Valori di riferimento I valori dell attività nel sangue della fosfatasi alcalina normalmente variano fra 110 e 700 UI/l nei bambini fino a un anno, fra 110 e 550 UI/l da 1 anno a 10 anni, fra 130 e 700 UI/l da 10 a 15 anni, fra 50 e 220 UI/l negli adulti.

20 Metodi Enzimatici di Analisi Gli enzimi vengono usati spesso per identificare e/o per quantificare sostanze chimiche specifiche in soluzione. I vantaggi sono derivati dal fatto che le reazioni enzimatiche sono veloci e molto specifiche per la natura dei substrati e che, anche in condizioni molto blande, catalizzano reazioni che raramente procedono a velocità significative. La specificità degli enzimi può superare la necessità di rimuovere materiali interferenti dai campioni. ESEMPIO: GLUCOSIO metodo GOD-POD

21 Saggi di Attività Enzimatica È possibile determinare la quantità di enzimi particolari in fluidi biologici misurandone l attività con substrati specifici. Per queste determinazioni si misura la velocità di conversione di un particolare substrato in prodotto invece del grado a cui procede la reazione.

22 La cinetica della maggior parte delle reazioni enzimatiche è descritta dalla equazione di Michaelis-Menten: La velocità di una reazione enzimatica aumenta con l aumentare della [S] fino a raggiungere un limite oltre il quale non aumenta più (saturazione = tutto E è legato a S sottoforma di complesso ES) ma resta costante a meno che non si aumenta [E]

23 Per valutare l attività enzimatica, viene impiegata una concentrazione di substrato [S] >> K M in modo che la V 0 misurata corrisponda con buona approssimazione alla V max : Queste condizioni sperimentali sono note come cinetica di ordine zero: non c è alcuna dipendenza dalla concentrazione del substrato, la velocità osservata è proporzionale alla concentrazione di enzima.

24 Unità di attività enzimatica e dosaggio degli Enzimi Catal (kat): è la quantità di enzima che converte 1 mole di reagente nel prodotto in 1 secondo nelle condizioni di reazione standard (ottimali). L Unità internazionale (U o UI): corrisponde alla quantità di enzima che converte 1 mole di reagente nel prodotto in 1 minuto. Poiché 1 mole /min = moli/s quindi U = kat. La concentrazione enzimatica è espressa come UI/L o sottomultipli UI/mL (in alcuni casi anche UI/mg).

25 Fattori che influenzano le reazioni catalizzate dagli enzimi Inibitori Molti enzimi sono inibiti da varie sostanze, pertanto bisogna tenere conto di questi fattori e usare controlli appropriati. Per es., agenti chelanti, come citrato e altri composti capaci di formare complessi bidentati con metalli sono spesso inibitori potenti di alcuni enzimi metallo-dipendenti come le chinasi. ph Temperatura Cofattori (co-enzimi e cofattori metallici)

26 ESERCITAZIONE: Misurazione sperimentale dei parametri cinetici della fosfatasi alcalina

27 Misure sperimentali e analisi dei dati cinetici Per misurare la velocità di reazione abbiamo bisogno di un sistema per seguire la formazione del prodotto o il consumo di substrato. Via via che il substrato viene consumato la velocità diminuisce fino a quando alla fine viene raggiunto l equilibrio. Di regola, si preferisce predisporre una serie di esperimenti tutti alla stessa concentrazione di enzima, ma a diverse concentrazioni di substrato e misurare la velocità iniziale (V 0 ).

28 Saggio Spettrofotometrico Spesso si usano metodi spettrofotometrici per monitorare le reazioni enzimatiche. Questi possono essere molto convenienti se il substrato o il prodotto contengono un gruppo cromoforo (o fluoroforo) distinto. Assorbimento della radiazione UV/visibile dovuto a transizioni energetiche degli elettroni degli strati esterni delle molecole. Quando la luce colpisce una molecola essa può essere trasmessa (nessuna interazione) o assorbita. Il livello di assorbimento della radiazione che attraversa un campione di sostanza in soluzione viene misurato da uno strumento noto come spettrofotometro.

29 Legge di Lambert e Beer L assorbimento di radiazione luminosa da parte di una sostanza in soluzione viene descritto quantitativamente con la legge di Lambert e Beer, l equazione fondamentale della spettrofotometria. A= Assorbanza (o densità ottica); è un numero adimensionale, il cui valore varia linearmente con la concentrazione della soluzione. ε=coefficiente di estinzione molare (mm -1 xcm -1 ); la densità ottica di una soluzione a concentrazione unitaria e misurata in un cammino ottico lungo 1 cm. È una costante specifica di ogni sostanza a una data lunghezza d onda. d=cammino ottico della soluzione (cm). C=Concentrazione della soluzione della sostanza (mm)

30 Reazione usata per la misura dell attività enzimatica della fosfatasi alcalina PNPP PNP ph = 9 2 mm Mg 2+ La fosfatasi alcalina è un enzima Mg-dipendente che catalizza l idrolisi di tutti i fosfomonoesteri. Si esegue il saggio enzimatico con un composto non naturale sintetizzato chimicamente: il p-nitrofenilfosfato (PNPP) che viene idrolizzato a p- nitrofenolo (PNP) e fosfato (P i ). La forma ionica del PNP è colorata (massimo di assorbimento a 405 nm) quindi la reazione può essere misurata spettrofotometricamente.

31 Poiché la variazione di [S] rispetto a t è pressoché lineare nelle fasi iniziali è possibile eseguire analisi accurate di V in funzione di [S].

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33 Una volta ottenuti i dati riguardo l andamento di V in funzione di [S] come è possibile determinare K M e k cat? Comunemente viene usato il grafico dei doppi reciproci o di Lineweaver-Burk che è un riarrangiamento dell equazione di Michaelis-Menten: 1/V = (K M +[S])/(V max [S])=K M /(V max [S])+[S] /(V max [S]) Ovvero: 1/V = K M /(V max [S])+1 /V max

34 Quando 1/[S] = 0 significa che [S] è infinitamente grande e la velocità di reazione è al suo valore massimo. Si noti che avendo V max e [E] t si può calcolare k cat, sapendo che V max = k cat [E] t. Per ottenere il valore di K m estrapoliamo il grafico di Lineweaver-Burk a un punto ipotetico in cui 1/V=0.