GLI ENZIMI. Sono molecole che catalizzano le reazioni in modo specifico.

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1 GLI ENZIMI Sono molecole che catalizzano le reazioni in modo specifico.

2 Fattori che influenzano una reazione enzimatica 1) Concentrazione del substrato

3 [S] crescenti Se la [E] è in eccesso rispetto al substrato S P (det. spettrofotometricamente) Velocità iniziale = dc/dt

4 CURVA DI MICHAELIS MENTEN Quando [S] satura tutti i siti enzimatici, si raggiunge la velocità di reazione max (cinetica di Ordine Zero) Se l enzima è in eccesso, la velocità di reazione aumenta all aumentare del substrato (cinetica di Primo Ordine)

5 Velocità di reazione v = dc/dt Cinetica di reazione di ordine zero V = K [E] Cinetica di reazione di primo ordine V = K [S]

6 ENZIMA MICHAELIANO Enzima come indicatore di danno Enzima come reagente

7 Fattori che influenzano una reazione enzimatica 2) Concentrazione dell enzima: quando la [S] è in eccesso rispetto alla [E], la velocità della reazione è proporzionale alla [E] 3) ph 4) Temperatura 5) Cofattori 6) inibitori

8 Il ph ottimale viene accuratamente mantenuto con l utilizzo di tamponi appropriati

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10 Fattori che influenzano una reazione enzimatica 2) Concentrazione dell enzima: quando la [S] è in eccesso rispetto alla [E], la velocità della reazione è proporzionale alla [E] 3) ph 4) Temperatura 5) Cofattori 6) inibitori

11 Alcuni enzimi necessitano di cofattori inorganici

12 e/o cofattori organici (coenzimi) I cofattori devono essere sempre aggiunti in eccesso nella miscela di reazione

13 Coenzimi piridinici

14 Fattori che influenzano una reazione enzimatica 2) Concentrazione dell enzima 3) ph 4) Temperatura (analisi a temp strett controllate) 5) Cofattori (sempre in eccesso) 6) inibitori

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16 Kmi > Km Vmaxi = Vmax INIBIZIONE COMPETITIVA

17 INIBIZIONE NONCOMPETITIVA Kmi = Km Vmaxi < Vmax

18 Dosaggi enzimatici Per essere dosati nel siero, urina o altri fluidi gli enzimi devono essere: Stabili durante la conservazione e l analisi del campione; Significativi dal punto di vita diagnostico Facilmente dosabili

19 La concentrazione degli enzimi viene calcolata in base alla loro attività enzimatica. La determinazione deve essere effettuata finchè la formazione del prodotto aumenta linearmente nel tempo (i primi minuti). [E4] [E3] [E2] [E1] A) La miscela di reazione viene fatta reagire per un tempo prestabilito, finito il quale si determina la quantità di prodotto ottenuto o di substrato consumato. B) La reazione viene seguita in continuo (saggio cinetico) mediante misurazioni successive ad intervalli di tempo prestabiliti

20 Le misurazioni in continuo sono preferibili perché permettono di individuare qualsiasi deviazione dalla linearità. L esempio piu comune di deviazione dalla linearità si verifica quando la concentrazione di E nel campione è cosi elevata che consuma tutto il substrato in tempi rapidissimi.

21 I livelli enzimatici vengono riportati come Unità enzimatiche (non concentrazione) E stato proposto l utilizzo dell UNITA INTERNAZIONALE (UI): 1UI è quella quantità di enzima che catalizza la trasformazione di 1 mmole di substrato in 1 minuto. La concentrazione enzimatica viene espressa come UI/L

22 TEST OTTICO SEMPLICE incolore giallo

23 TEST OTTICO ACCOPPIATO Consiste nell accoppiamento della reazione primaria con una seconda NAD- o NADP-dipendente (reazione indicatrice). Quando il prodotto dell enzima da dosare non è distinguibile otticamente dal substrato. E1 E2 L S P E1 = enzima da dosare E2 = enzima ausiliario (reazione rivelatrice)

24 TEST OTTICO ACCOPPIATO Affinchè la misura sia proporzionale al contenuto di E1 presente nel campione da dosare si devono realizzare 3 condizioni: - La reazione catalizzata da E1 deve essere di ordine zero rispetto a [L]. si realizza con un eccesso di L ([L]>> Km L ) - La reazione catalizzata da E2 deve essere di primo ordine rispetto a [S]. si realizza utilizzando E2 in largo eccesso ([S]<<Km s ) - Entrambe le reazioni devono essere irreversibili E1 E2 L S P L enzima E1 deve costituire il fattore limitante

25 TRANSAMINASI Alanina Aspartato piruvato ossalacetato

26 Enzimi nella diagnostica: le transaminasi AST = aspartato amminotrasferasi AST Aspartato + a-chetoglutarato ossalacetato + glutammato MDH Ossalacetato + NADH + H + malato + NAD + Reazione indicatrice accoppiata AST (GOT) = Aspartato aminotrasferasi

27 AST (sinonimo GOT) Indice di funzionalità epatica e muscolare Valori ematici normali (8-20 UI/l) Principalmente localizzata nel tessuto cardiaco, scheletrico ed epatico. La concentrazione intracellulare di AST è 1000 volte piu elevata rispetto alla concentrazione extracellulare. Aumenta nell epatite acuta e cronica, nell infarto del miocardio, nella distrofia muscolare, nella pancreatite acuta. Dopo danni gravi, i livelli di AST possono alzarsi in 6/10 ore e rimanere alti per circa 4 giorni.

28 AST (sinonimo GOT) Dopo danni gravi, i livelli di AST possono alzarsi in 6/10 ore e rimanere alti per circa 4 giorni. Utile nella diagnosi e nel controllo della terapia delle malattie epatiche. Nell epatite acuta: aumenta in tempi brevi ( UI/l) Nell epatite cronica: scarso aumento ( UI/l)

29 Enzimi nella diagnostica: le transaminasi ALT = alanina amminotrasferasi ALT Alanina + a-chetoglutarato piruvato + glutammato LDH Piruvato + NADH + H + Lattato + NAD + Reazione indicatrice accoppiata LDH = Lattico Deidrogenasi ALT (GPT) = Alanina aminotrasferasi

30 ALT (sinonimo GPT) Indice di funzionalità epatica Valori ematici normali (10-25 UI/l) Principalmente localizzata nel tessuto epatico. Aumenta nell epatite acuta e cronica. Nel danno infiammatorio acuto il livelli di ALT sono superiori ai livelli di AST e rimangono elevati nel sangue piu a lungo.

31 Enzimi nella diagnostica: la lattato deidrogenasi LDH Piruvato + NADH + H + Lattato + NAD + Valori ematici normali ( UI/l) I Livelli aumentano in patologie epatiche, cardiache, muscolari, renali ed ematologiche Molti farmaci possono indurre un aumento sierico di tale enzima: anestetici, dicumarolici, nitrofurantoina, ecc Gli eritrociti hanno una concentrazione di LDH volte maggiore rispetto a quella che si trova nel sangue

32 Isoenzimi Sono forme multiple di un enzima che catalizzano la stessa reazione, ma differiscono nella struttura (sono codificate da geni distinti). Hanno spesso costanti catalitiche (Km, Vmax) diverse. Sono presenti in tessuti diversi (cuore, fegato, ecc.)

33 Glucokinase and Hexokinase are typical examples of isoenzymes. In fact, there are four Hexokinases: I, II, III and IV. Hexokinase I is present in all mammalian tissues, and Hexokinase IV (Glucokinase) is found mainly in liver. Both enzymes catalyze the phosphorylation of Glucose: Glucose + ATP Glucose 6 P + ADP

34 G6P x È irreversibile Esochinasi I: È presente in tutte le cellule Reagisce anche con altri monosaccaridi Km = 0.1 mm È indipendente da insulina Inibita da G6P Glucochinasi (esochinasi IV): È presente solo nel fegato Reagisce solo con glucosio (è specifica) Km = 10 mm È inducibile con insulina Non inibita da G6P

35 Glucokinase and Hexokinase are typical examples of isoenzymes. In fact, there are four Hexokinases: I, II, III and IV. Hexokinase I is present in all mammalian tissues, and Hexokinase IV (Glucokinase) is found mainly in liver. Both enzymes catalyze the phosphorylation of Glucose: Glucose + ATP Glucose 6 P + ADP Hexokinase I has a low Km and is inhibited by glucose 6 (P). Glucokinase is not inhibited by Glucose 6 (P) and his Km is high. Since Glucokinase is not inhibited by glucose 6 phosphate, in conditions of high concentrations of glucose this enzyme continues phosphorylating glucose, which can be used for glycogen synthesis in liver. Additionally, since Glucokinase has a high Km, its activity does not compromise the supply of glucose to other organs; in other words, if Glucokinase had a low Km, it would continue converting glucose to glucose 6 phosphate in the liver, making glucose unavailable for other organs (remember that after meals, glucose arrives first to the liver through the portal system).

36 Lattico Deidrogenasi (LDH) è un tetramero costituito da 2 tipi di subunità (H e M) 33% 45% 18% 3% 1% Nel siero di individui sani Isoenzima H4 nel cuore M4 nel muscolo scheletrico

37 È un modo per ri-ossidare il NADH

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40 In myocardial infarction, total LDH increases, and since heart muscle contains more LDH1 than LDH2, LDH1 becomes greater than LDH2 between 12 and 24 hours, after the infarction, so the ratio LDH1/LDH2 becomes higher than 1 and will stay flipped for several days.

41 Enzimi nella diagnostica: la creatin chinasi l isoenzima CPK2 compare nel siero generalmente 4-8 ore dopo l episodio acuto e raggiunge un massimo dopo 24 ore scompare dal plasma dopo 48 h (degradato)

42 Vie di produzione dell ATP Glicolisi anaerobica Fosforilazione ossidativa Creatina chinasi Fosforilazione a livello del substrato nel ciclo di Krebs ATP Adenilato chinasi

43 Phosphocreatine ADP Creatine kinase ATP Creatine Phosphocreatine ADP ATP Creatine

44 Vie di produzione Substrati Velocità di produzione di ATP (mmol/g/s) ATP ricavabile dalla completa utilizzazione dei substrati (mmol/g) Tempo per la totale scomparsa dei substrati Creatina chinasi Fosfocreatina s Glicolisi anaerobia Glicogeno min Fosforilazione ossidativa mitocondriale Glicogeno e glucosio min Fosforilazione ossidativa mitocondriale Acidi grassi milioni 83 ore E. Newsholme, The Biochemist, 14-17, June 1998

45 % of total contribution to ATP production glicolisi Fosforilazione ossidativa fosfocreatina Time (sec.)

46 Enzimi nella diagnostica: la creatin chinasi l isoenzima CPK2 compare nel siero generalmente 4-8 ore dopo l episodio acuto e raggiunge un massimo dopo 24 ore scompare dal plasma dopo 48 h (degradato)

47 Determinazione spettrofotometrica della creatin chinasi

48 Sintesi della creatina

49 CK3 CK2 CK1

50 CK-MB nella diagnosi dell infarto acuto

51 Isoenzimi della CK - catodo + anodo L esempio presentato mostra la separazione elettroforetica di diversi campioni di plasma su gel di agarosio. Le isoforme sono state rese visibili aggiungendo direttamente i substrati sulla lastrina ed evidenziando l NADPH, prodotto dalla catena di reazioni enzimatiche, in base alla sua fluorescenza. La banda MM3 è in posizione catodica ed è la più lenta, mentre la banda MB1 è in posizione anodica ed è quella con maggiore mobilità elettroforetica. Una determinazione semiquantitativa della concentrazione relativa delle diverse isoforme può essere ottenuta per mezzo di un fotometro a scansione.

52 Proteine mutate nelle distrofie muscolari

53 Enzimi nella diagnostica: la g-glutamil trasferasi (GGT) Enzima presente in tutti i tessuti, particolarmente nel rene e nel fegato, a livello dei dotti biliari. [GGT] aumenta: 1) Ostruzione dei dotti biliari 2 ) Abuso cronico di alcol Negli alcolisti, la GGT sierica aumenta per un meccanismo di induzione enzimatica, quindi indipendentemente dalla presenza o meno di danno epatico alcol-correlato (se presente, comunque, l'aumento della GGT è più consistente).

54 Determinazione spettrofotometrica della GGT COO - GGT colorato COO - Misura in bicromatismo (405 e 600 nm)

55 Per migliorare il metodo, Persijn studiò i derivati del Glu-4-NA e scoprì che il γ-glutamil-3- carbossi-4-nitroanilide era superiore al Glu-4-NA dal punto di vista della solubilità e stabilità.

56 Le fosfatasi sono enzimi che determinano l idrolisi di fosfomonoesteri (idrolizzano il legame estereo). Si distinguono in base al ph ottimale d azione ALCALINA (ph 9-10) ACIDA (ph 5)

57 FOSFATASI ALCALINA (ALP) ALP è presente soprattutto nel fegato (canalicoli biliari) e nelle ossa (osteoblasti), placenta e rene. FOSFATASI ALCALINA (ALP) aumenta nelle: affezioni del sistema epato-biliare (poco in cirrosi, epatite); Alterazioni della sostanza ossea (rachitismo, metastasi ossee, Morbo di Paget); Iperparatiroidismo Patologie infiammatorie croniche intestinali

58 Determinazione spettrofotometrica della fosfatasi alcalina ALP ph 10 incolore giallo

59 CARATTERISTICHE DEI PRINCIPALI ISOENZIMI DELLA ALP

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61 FOSFATASI ACIDA (ACP) ACP è presente soprattutto nella prostata, milza rene, globuli rossi, piastrine FOSFATASI ACIDA (ACP) aumenta nel: Carcinoma della prostata

62 Determinazione spettrofotometrica della fosfatasi acida ACP incolore ph 5 Incolore Diventa giallo dopo aggiunta di alcali Per determinare l ACP prostatica si sfrutta la sua caratteristica di essere inibita da L-tartrato. Si sottopone campione a dosaggio in assenza e in presenza di L-tartrato e si misura la differenza tra i due. ACP prostatica = ACP totale ACP dopo inibizione con tartrato

63 Enzimi nella diagnostica: amilasi Indice di funzionalità pancreatica Valori UI/L Sono enzimi idrolitici implicati nella scissione dei polisaccaridi Vengono prodotti in vari organi da cui prendono il nome (isoenzimi): salivare (ptialina) presente anche nel sudore, lacrime, liquido amniotico; pancreatica, viene rilasciata nell intestino

64 AMILASI aumenta nelle: Pancreatiti acute (livelli volte superiore rispetto a individui sani, raggiunge il massimo dopo 24 h); Determinazione spettrofotometrica dell amilasi

65 Enzimi nella diagnostica: lipasi Indice di funzionalità pancreatica Valori UI/L Sono enzimi che catalizzano l idrolisi dei trigliceridi Vengono prodotti principalmente dal pancreas LIPASI aumenta nelle: Pancreatiti acute (è più specifica dell amilasi, si libera più tardivamente e permane più a lungo in circolo);

66 Determinazione della lipasi Metodo titrimetrico Una emulsione di olio d oliva viene incubata con un campione di plasma. Gli acidi grassi eventualmente formati vengono titolati con NaOH (indicatore timolftaleina) Metodo turbidimetrico Più rapido e semplice, si basa sul fatto che i grassi in ambiente acquoso creano un emulsione.

67 Enzimi nella diagnostica: la tripsina Prodotta esclusivamente dalle cellule acinose pancreatiche. Si dosa solo con metodi radioimmunologici, il che riduce la sua applicabilità in emergenza clinica. I livelli aumentano 5-10 volte nel corso di panceatite acuta e permangono elevati per 4-5 giorni dall inizio dei sintomi.

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