4.2 CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC)

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1 1 4.2 CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC) In questa tecnica cromatografica, la fase stazionaria è costituita da materiali diversi (solidi attivi, liquidi supportati su particelle solide inerti, cellulose modificate scambiatrici di ioni) stratificati a spessori sottili su superfici piane (lastrine di vetro, fogli di alluminio, fibre di vetro, fogli o lastre di resine) che ne costituiscono il supporto meccanico. La TLC (Thin layer chromatography) si può considerare una moderna evoluzione della cromatografia su carta (PC). I meccanismi di separazione dei componenti delle miscele, si basano sui fenomeni di: adsorbimento: se la fase stazionaria è costituita da un solido granulare attivo (dotato cioè della capacità di formare sulla superficie dei granuli, legami chimici secondari con le molecole dei componenti le miscele) ripartizione: se la fase stazionaria è un liquido fissato su un supporto solido granulare, possibilmente del tutto inerte scambio ionico: se la fase stazionaria ha la capacità di scambiare ioni (per es. cellulose modificate come quelle fosforilate, carbossimetil cellulose ecc.) esclusione: se la fase stazionaria è un gel del tipo setacci molecolari Per quanto riguarda le applicazioni di questa tecnica è opportuno precisare che: riveste un ruolo di primo piano nel campo dell analisi qualitativa organica per l identificazione dei composti è una tecnica utilissima nel campo della ricerca, nella separazione di isomeri difficilmente separabili può essere usata a scopo preparativo (PLC) impiegando lastre con strati di fase stazionaria a maggiore spessore, per separare componenti difficilmente separabili, accumulandone quantità piccole ma sufficienti per altre indagini strumentali (spettrofotometrie, MS, NMR ecc.) è meno impiegata per determinazioni quantitative dei componenti separati non riveste un ruolo importante, anzi è pochissimo utilizzata nel campo dell analisi ambientale. Gli unici impieghi della TLC previsti nei metodi ufficiali di analisi disposti dalle leggi vigenti in tema di controlli ambientali, sono quelli per la determinazione degli IPA (idrocarburi policiclici aromatici) nell aria. In realtà la tecnica dello strato sottile preparativo (PLC) in questo metodo ufficiale rappresenta solo un trattamento preliminare di purificazione delle soluzioni ottenute estraendo con solventi organici, campioni di particolato atmosferico, prima di sottoporre le frazioni così separate, ad analisi gascromatografica 1

2 Materiali ed apparecchiature a. Fasi stazionarie solide (adsorbimento) Si usano materiali granulari a granulometria regolare e controllata, dotati di forti capacità adsorbenti quali: gel di silice: acido silicico amorfo polimerizzato, poroso; presenta molti gruppi -OH liberi come gruppi funzionali attivi allumina (neutra, basica, acida): si ottiene con tecniche diverse da idrossido di alluminio disidratato ad alta temperatura; può presentare diversi gradi di attività a seconda delle percentuali di acqua residue, presenti nel materiale. Le diverse attività sono classificate secondo una scala che va da I a V nel senso delle capacità di adsorbimento decrescenti Kieselguhr: polveri di diatomee (acido silicico amorfo) poliammidi (polveri): tipo nylon 66 silicato di magnesio (florisil) fosfato di calcio, solfato di calcio ecc. b. Fasi stazionarie liquide (ripartizione) Possono essere: acqua: è normalmente presente a discrete percentuali, nella cellulosa che è quindi un materiale idoneo alla TLC di ripartizione liquidi lipofili supportati su cellulosa, kieselguhr: paraffine > C 12, oli minerali, oli al silicone c. Fasi mobili Sono in genere solventi organici a diversa polarità. Esistono in letteratura degli elenchi di solventi organici utilizzabili come fasi mobili, scelti da vari Autori e disposti in ordine di polarità crescente (serie eluotropiche). A titolo di esempio si può citare quella di Stahl che prevede i seguenti eluenti: n-esano, eptano, cicloesano, CCl 4, benzene, CHCl 3, etere dietilico, acetato di etile, piridina, acetone, metanolo, acqua. Tali solventi possono essere usati puri o in miscela tra loro, a diverse proporzioni, per graduare le polarità come si desidera. d. Apparecchiature Per quanto riguarda le apparecchiature si possono citare: camere di sviluppo: sono in vetro, di dimensioni e formati diversi, munite di coperchi a tenuta.alla loro base si mettono gli eluenti (solventi puri o miscele di solventi). Le lastrine di vetro su cui è stratificato lo strato sottile di fase stazionaria, pescano nell eluente che quindi sale attraverso di esse per capillarità (tecnica ascendente). Le camere devono essere a tenuta perchè l ambiente deve risultare saturo dei vapori dell eluente; in un ambiente non saturo, questo non salirebbe infatti attraverso la lastrina oltre una certa altezza perchè si stabilirebbe un equilibrio tra liquido che sale per capillarità ed eluente che evapora 2

3 3 stratificatore: apparecchiatura su cui si dispongono le lastrine di vetro lavate e sgrassate; quindi si fa scorrere su esse (manualmente o automaticamente) una vaschetta contenente una sospensione della fase stazionaria in acqua. Al materiale costituente la fase stazionaria, contenente generalmente anche CaSO 4 come legante, per farla aderire alle lastrine, si possono aggiungere, nel preparare la sospensione, degli indicatori di fluorescenza (F 254 e/o F 366 ). Questi indicatori consentono, irradiando le lastrine al buio con lampade di Wood che emettono nelle zone 254 e 366 nm, di vedere le sostanze non colorate presenti su di esse, scure sullo sfondo luminoso fluorescente della lastrina attivata. La vaschetta scorrendo sulle lastrine, lascia dietro di sè uno strato di fase stazionaria di spessore regolabile. Dopo la stratificazione le lastrine si essiccano prima all aria e poi si attivano in stufa. Oggi sono disponibili in commercio lastrine già pronte del tipo usa e getta confezionate con le fasi stazionarie più importanti; esse hanno uno spessore di strato e una granulometria controllati e quindi presentano una maggiore efficienza e migliore riproducibilità di risultati. depositori dei campioni: possono essere o dei semplici capillari di vetro o dei microcapillari tarati, micropipette, microsiringhe di precisione ecc Tecniche operative Le fasi in cui si articola una normale cromatografia TLC, sono: a) semina dei campioni su una linea di partenza b) eluizione o sviluppo del cromatogramma c) rivelazione del cromatogramma a. semina dei campioni: si traccia con una matita sulla lastrina, una linea di base o linea di partenza, parallela al lato a 2-3 cm da esso (Fig. 1). Con un capillare, una micropipetta o una microsiringa, si seminano i campioni da separare come macchie, avendo cura che non si allarghino troppo, lungo la linea di base (Fig. 1a), insieme ad eventuali standard di confronto. Si può seminare anche un Fig. 1 campione (in questo caso cioè una sola miscela) come una banda deposta lungo tutta la linea di partenza (Fig. 1b) b. sviluppo del cromatogramma: si immerge la lastrina nell eluente (fase mobile) posto alla base della camera di sviluppo, facendo attenzione a che la linea di partenza sia al di sopra del pelo libero della fase mobile (Fig.2). Si chiude il coperchio a tenuta; l eluente sale attraverso la Fig. 2 lastrina per capillarità (sviluppo ascendente), trasportando con sè le macchie (o la banda). Il trasporto è selettivo perchè, a causa delle diverse polarità dei componenti la miscela, questi risultano più o meno affini alla fase stazionaria. I componenti più affini (adsorbiti più fortemente sulla fase stazionaria solida o più solubili nella fase stazionaria se liquida) restano indietro perchè maggiormente trattenuti dalla fase stazionaria; i meno affini ad essa vengono invece trasportati dall eluente, più in alto. L eluente viene fatto migrare per un certo tratto (di solito 15-16cm) per lastrine di 3

4 4 dimensioni 20x20cm, quindi si segna con una matita la linea cui è arrivato (fronte del solvente) e si toglie la lastrina dalla camera di sviluppo c. rivelazione del cromatogramma: dopo aver fatto evaporare all aria l eluente che bagna la lastrina, si passa alla rivelazione del cromatogramma. La rivelazione può essere fatta in due modi : rivelazione con sistemi non distruttivi: le lastrine, con fasi stazionarie addizionate di indicatori di fluorescenza sensibili alle radiazioni UV comprese in un certo range di lunghezze d onda, vengono irradiate con lampade che emettono in una banda intorno a 254 nm e 366 nm. Osservate al buio, esse presentano una fluorescenza verde che lascia vedere la posizione delle macchie o delle bande (scure in campo chiaro). Esse si possono segnare con una matita e quindi si può eventualmente asportare la fase stazionaria dalla lastrina grattando con una spatola rivelazione chimica (distruttiva): le lastrine vengono spruzzate con soluzioni di reattivi che reagiscono con i componenti sviluppando, a temperatura ambiente o a caldo, delle macchie colorate che individuano i diversi componenti della miscela e gli standard di confronto. I rivelatori chimici si possono distinguere in universali, di uso generale e capaci di rivelare qualunque composto, e specifici che reagiscono solo con determinate classi di composti (es. ninidrina per gli amminoacidi, SbCl 3 in cloroformio per terpeni, steroidi ecc.) La tecnica detta di strato sottile preparativo (PLC) serve ad eluire, separare e raccogliere i vari componenti di una miscela, allo stato puro. In questo caso le lastrine presentano spessori di fase stazionaria più grandi rispetto a quelle analitiche (da 2 a 10 mm max contro 0.25 mm di quelle analitiche). Su di esse possono essere caricate quantitativi di miscela fino a 100 mg (contro i µg della TLC analitica). La semina della miscela da separare viene fatta in un unica banda sulla linea di partenza. Dopo l eluizione si procede così: Fig. 3 si individuano le bande appartenenti ai diversi componenti (Fig. 3) della miscela, utilizzando una lampada UV oppure spruzzando un rivelatore chimico solo su una sottile striscia laterale e coprendo con un foglio il resto dalla lastrina si segnano le bande individuate, con una matita si raschia con una spatola la fase stazionaria corrispondente alle diverse bande si mette la polvere raschiata in un imbuto a setto poroso di vetro e si eluisce con un solvente polare, raccogliendolo si porta a secco il solvente e si ricava il componente puro separato dalla miscela 4

5 Prestazioni I principali parametri con cui si valutano le prestazioni di una TLC sono: selettività efficienza riproducibilità selettività: si evidenzia mediante la corsa relativa delle diverse macchie (componenti) lungo la lastrina. Si misura numericamente per ogni componente con il fattore di ritenzione R f (ratio front). Esso è un parametro (R f assoluto) definito come (Fig. 4): R A f ha = R h S B f = h h B S h S = distanza percorsa dall eluente dalla linea di partenza al fronte del solvente Fig. 4 h A,B = distanza percorsa dalla macchia del componente A, B,... Si ha naturalmente maggiore selettività quando i valori di Rf rilevati, risultano molto diversi tra loro. efficienza: capacità delle macchie dei singoli componenti, di migrare compatte senza diffondere nella fase stazionaria (allargandosi e deformandosi). L efficienza è legata ai fattori: Φ medio dei granuli omogeneità dei Φ dei granuli (non devono essere troppo diversi tra loro) omogeneità nell impaccamento dello strato riproducibilità: essa è la prestazione maggiormente richiesta. A parità di tutti gli altri fattori da cui dipende una TLC, è garantita da: riproducibilità degli spessori dello strato sottile temperatura di sviluppo (cambiano i coefficienti di adsorbimento e di ripartizione) quantità di miscela seminata 5

6 Cenni sull analisi qualitativa e quantitativa in TLC a. Analisi qualitativa L identificazione di un componente tramite misura del valore del suo R f assoluto non dà affidamento a causa dei numerosi fattori che influenzano i risultati di una TLC e che ne compromettono la riproducibilità. I metodi preferibili sono invece: confronto con uno standard fatto migrare sulla stessa lastrina, in parallelo con la miscela. Sostanze che migrano alla stessa altezza e che assumono la stessa colorazione con rivelatori specifici, possono ritenersi ragionevolmente uguali localizzazione della macchia (o della banda) con la lampada UV o con la tecnica della doppia semina (una si sacrifica spruzzando con il rivelatore per localizzarla e l altra si usa per l analisi), sua asportazione insieme alla fase stazionaria, eluizione con un solvente ed identificazione conclusiva con altre metodiche strumentali come IR, UV, GC, HPLC, MS b. Analisi quantitativa L analisi quantitativa in TLC non offre un accuratezza ed una riproducibilità elevate. Tuttavia i metodi più accurati ed affidabili sono: determinazione dell intensità delle colorazioni delle macchie mediante una misura delle loro riflettanze con un fotodensitometro a scansione [ riflettanza R= log I R / I 0 dove I R = intensità della luce riflessa dalla macchia I 0 = intensità della luce riflessa da una superficie bianca Il fotodensitometro trasforma i valori di riflettanza in picchi (minore riflettanza = macchia più intensa e picco di area maggiore) la cui area è proporzionale alle quantità di sostanza. Occorrono naturalmente delle rette o delle curve di taratura, costruite utilizzando macchie ottenute da soluzioni standard con volumi seminati esattamente misurati localizzazione delle macchie mediante UV e indicatori di fluorescenza oppure con la tecnica della doppia semina; le macchie vengono quindi asportate insieme alla fase stazionaria, eluite con un solvente e dosate per via strumentale (spettrofotometria, GC, ecc.) 6