Breve manuale per l utilizzo del gas-cromatografo HRGC 5300

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1 Breve manuale per l utilizzo del gas-cromatografo HRGC 5300 Elementi principali del gas-cromatografo HRGC 5300 SISTEMA DI ALIMENTAZIONE GAS DI TRASPORTO: si tratta di bombole di gas inerte (azoto, elio, argon), talvolta può essere utilizzato anche l idrogeno. Lo scopo principale è quello di trascinare i componenti della miscela in analisi lungo la colonna cromatografica SISTEMA DI ALIMENTAZIONE DEI GAS PER IL RIVELATORE FID: utilizzando questo rivelatore è necessario alimentare un combustibile ed un comburente (ad esempio idrogeno ed aria). COLONNA CAPILLARE: Le colonne capillari sono sottilissimi tubi di silice di diametro generalmente non superiore agli 0,53 millimetri e di lunghezza non inferiore ai 10 metri avvolte a spirale su un supporto metallico. La fase stazionaria è spalmata in maniera uniforme sulla superficie interna della colonna, dove forma un film di spessore costante che, a seconda del potere risolutore della colonna, varia generalmente tra 0,5 e 2,5 µm. Il film è spesso costituito da metil-siliconi modificati su cui sono inseriti vari gruppi funzionali, in funzione della classe di composti da analizzare. CAMERA TERMOSTATICA: camera nella quale è alloggiata la colonna. In genere queste camere è a circolazione di aria calda per assicurare una buona stabilità di temperatura. Un dispositivo (in questo caso il programmatore MFC 500) permette all operatore di fissare la temperatura, la quale può essere mantenuta costante per tutta la durata d analisi (isoterma) oppure fatta variare (programmata).

2 CONTROLLO MULTI FUNZIONE MFC 500: questo strumento è la stazione di controllo del gascromatografo HRGC 5300 MEGA SERIES con il quale vengono determinati tutti i parametri cromatografici necessari ad una buona analisi. RIVELATORE FID: un rivelatore a ionizzazione di fiamma si dice distruttivo in quanto i componenti della miscela in analisi, separati dalla colonna cromatografica e trascinati dal gas di trasporto, solitamente azoto, vengono miscelati ad una debole corrente di idrogeno e quindi avviati al rivelatore dove vengono combusti all uscita di un ugello ai cui lati sono disposti due elettrodi. Fra i due elettrodi viene applicata una differenza di potenziale di V attraverso un alta impedenza connessa con un amplificatore elettrometrico. La microfiamma viene mantenuta dal flusso di idrogeno che brucia in atmosfera d aria. La debolissima corrente ionica che ne deriva viene opportunamente elaborata da un amplificatore elettrometrico (E) che la preleva ai capi di una resistenza ad altissimo valore R e quindi inviata sotto forma di tensione ad un registratore V che ne traccia le variazioni. Quando nella fiamma oltre all idrogeno e al gas di trasporto passa un componente della miscela la ionizzazione aumenta notevolmente per cui si ottengono elevatissime risposte con ottima stabilità della linea di base. La sensibilità di questo rivelatore viene espressa in Coloumb/g ed è di circa mille volte superiore a quella dei rivelatori a conducibilità termica. La dinamica di risposta lineare di questo rivelatore è la più ampia di tutti i rivelatori fino ad ora conosciuti, infatti la fiamma produce ioni in proporzione diretta fino a quantità di sostanza nell ordine di 10-5 g/sec e, tenendo presente che possono essere rivelate quantità dell ordine di 10-13, ne risulta una dinamica di INIETTORE: ha la funzione di assicurare l istantanea vaporizzazione del campione, iniettato attraverso una micro siringa. L uso di colonne capillari, però, richiede che la quantità di campione da iniettare è all ordine dei nanolitri e misurare queste quantità con siringhe è praticamente impossibile. Per questo motivo, spesso, si utilizza lo split, che consente di far entrare effettivamente

3 in colonna solo una parte (ad esempio 1/100) del liquido iniettato. La camera di iniezione è corredata da un sistema di resistenze variabili attraverso le quali è possibile fissare la temperatura ritenuta più adatta per la vaporizzazione della miscela. L introduzione del campione viene effettuata con un iniezione su un apposito disco di gomma al silicone, posto tra una ghiera metallica e il dispositivo di attacco alla colonna. CAMPIONATORE AUTOMATICO: ha la funzione di campionare automaticamente le miscele da analizzare, velocizzando le analisi in serie e permettendo una notevole diminuzione dovuto all utilizzo della siringa manuale. CONTROLLO CAMPIONATORE AUTOMATICO HS CONTROL Mod. 250: ha la funzione di programmare tutti i parametri riguardanti il campionatore, come tempo di iniezione o temperatura della siringa.

4 ELETTROMETRO EL Mod. 580: questo strumento ha lo scopo di amplificare la debolissima corrente ionica derivante dal FID, trasformarla in tensione elettrica e di inviarla ad un registratore. INTEGRATORE: il segnale in uscita dal rivelatore passa ad un registratore che ha il compito di realizzare il tracciato cromatografico. Lo strumento è corredato anche di un integratore che permette il calcolo automatico delle aree dei picchi, operazione indispensabile per effettuare analisi di tipo quantitativo. Impostazione dei parametri per l analisi CONTROLLO MULTI FUNZIONE MFC 500

5 Sullo strumenti sono presenti: tasti di funzione, tasti di controllo e tasti numerici. I tasti di funzione sono i seguenti: TIME SB : Tempo di standbay, cioè tempo di ottimizzazione dello strumento. SB & TEMP 1: Tempo di ottimizzazione della temperatura TEMP 1: Primo livello di temperatura programmabile TIME 1: Tempo di utilizzo di TEMP 1 RATE 1: Prima programmazione di temperatura della prima rampa TEMP 2: Secondo livello di temperatura programmabile TIME 2: Tempo di utilizzo di TEMP 2 RATE 2: Seconda programmazione di temperatura della prima rampa TEMP 3: Terzo livello di temperatura programmabile TIME 3: Tempo di utilizzo di TEMP 3 RATE 3: Terza programmazione di temperatura della prima rampa TEMP 4: Quarto livello di temperatura programmabile TIME 4: Tempo di utilizzo di TEMP 4 RATE 4: Quarta programmazione di temperatura della prima rampa TIME 5: Tempo utile per il condizionamento e per la preparazione del sistema per un nuovo ciclo Queste funzioni vengono utilizzate per impostare la programmata, quindi le temperature del forno nelle rampe e nelle isoterme. Per fare ciò, tenendo premuto il tasto del parametro da inserire, digitare le nuove impostazioni e confermare con ENTER. I tasti di controllo sono i seguenti: START: consente di far partire l analisi dal punto iniziale o, continuandolo a premere, da qualsiasi altro punto della programmata. RESET: premendolo contemporaneamente a ENTER, consente di fermare l analisi senza alterare i parametri immessi in precedenza e di tornare all inizio della programmata. Per far ripartire l analisi nuovamente, premere START. SB COOL: ad analisi terminata, premendolo contemporaneamente a ENTER, consente di raffreddare in tempi brevi la camera termostatica. E possibile attivarlo anche durante un analisi resettando prima il programma in corso. ZONE 1: consente di inserire la temperatura desiderata dell iniettore di sinistra.

6 ZONE 2: consente di inserire la temperatura desiderata dei 2 rivelatori FID. ZONE 3: consente di inserire la temperatura desiderata dell iniettore di destra. ZONE POWER: consente di attivare il riscaldamento delle 3 zone, premendolo contemporaneamente a ENTER. Conseguentemente si accende una luce rossa che indica che la funzione si è attivata. LIST: mostra le temperature e i tempi della programmata. ACTUAL TEMP: mostra le temperature attuali del forno e delle 3 zone. I tasti numerici sono i seguenti: Da 0 a 9: consentono di inserire i parametri nelle varie funzioni. CLEAR: permette di modificare i parametri inseriti scorrettamente. K: consente di visualizzare le temperature in Kelvin. CHRONO: permette di attivare e disattivare il cronometro in secondi. Per azzerarlo premere il tasto CLEAR. Ogni funzione ha il proprio display, che indicano i vari parametri attuali. In particolare è utile descrivere il display della camera termostatica, formato da luci (LEDS) che indicano le sue condizioni, tra cui: READY LED informa che si trova alla temperatura impostata; COND LED informa che sta raggiungendo la temperatura impostata; COOL LED informa che si trova nella fase di raffreddamento. Inoltre altri LED particolari sono i READY LEDS, che si accendono nel momento in cui anche le tre zone hanno raggiunto i parametri impostati. CONTROLLO ELETTROMETRO EL Mod. 580

7 Il EL-580 comprende i seguenti controlli mostrati nella figura sovrastanti, essi sono: - Il controllo d ATTENUAZIONE viene effettuato attraverso le frecce (1); è possibile impostare 11 diversi parametri (da 2 0 a 2 10 ), il valore impostato è visibile sul display (2). - Il RANGE 10 n (3) permette di cambiare l input inviato all integratore; è possibile impostare quattro diversi parametri (3). Il valore impostato è visibile sul display (4). - Il controllo del BACK-OFF READ (5) è attivabile per valutare e misurare il rumore di fondo del sistema cromatografico. - Il controllo ZERO OFFSET (6) è attivabile per spostare la linea di base in posizioni più convenienti. Quando questa funzione è attiva il led corrispondente (10) è acceso. - Il controllo AUTOZERO serve per eliminare il rumore di fondo tramite un potenziometro automatico, ottenendo così un aggiustamento della linea di base. Quando il tasto di AUTOZERO viene premuto il led (8) si accende e dopo il tempo necessario per la correzione della linea di base (da 2 a 10 set) si spegne. - Il tasto IGNITION (9) serve per accendere la fiamma nel FID. Il led corrispondente (11) si accende quando il tasto è premuto. CONTROLLO CAMPIONATORE AUTOMATICO HS CONTROL Mod. 250 Il campionatore automatico consente di effettuare analisi in modo ripetitivo e autonomo. E costituito dalle seguenti parti: - Un piatto rotante portacampione termostatato, nel quale si possono inserire fino a 40 vials (tipo di provetta). - Un braccio pneumatico con siringa, anch essa termostatata. - Un controllo per la pressione dei pistoni (il campionatore automatico viene mosso con aria compressa, il cui valore ottimale è di circa 3 atm.). - Un modulo che consente di impostare tempi e temperature. Il modulo è alloggiato sopra al controllo del forno e possiede i seguenti tasti di controllo: - SYRINGE TEMP: imposta la temperatura della siringa, fino ad un massimo di 199 C - BATH TEMP: imposta la temperatura del bagno, fino ad un massimo di 199 C (c è anche la possibilità di controllare il bagno tramite un sistema esterno). Questi due controlli, che possono essere esclusi se non necessari, sono molto utili sia per l analisi di miscele viscose sia per la tecnica dello spazio di testa. - TURNTABLE: ruota il piatto portacampioni di una posizione. - CONDITIONING TIME: imposta il tempo di condizionamento, cioè il tempo d attesa prima dell inizio dell analisi.

8 - ANALYSIS TIME: imposta la durata dell analisi, al termine della quale ricomincerà un nuovo ciclo condizionamento-analisi (con il campionatore è possibile eseguire molte analisi in successione in modo automatico). - CLEAN STROKES: imposta i cicli di pulizia che affronterà la siringa prima di prelevare il campione (da 1 a 7) Sono inoltre presenti una serie di led che indicano: - BATH TEMP READY: si accende quando la temperatura del bagno è raggiunta. - SYRINGE TEMP READY: si accende quando la temperatura della siringa è raggiunta. - READY: si accende quando tutti i parametri impostati sono raggiunti (l analisi stessa non parte se questa spia non è accesa). Altri pulsanti sono collegati a led e permettono di : - EVEN: analizzare il contenuto dei vials pari. - ODD: analizzare il contenuto dei vials dispari. - STOP: fermare il campionatore. - MAN: far partire il campionatore con modalità manuale, cioè effettuare soltanto un analisi. - AUT: far partire il campionatore con modalità automatica in isoterma (dopo aver precedentemente impostato i tempi di analisi e di condizionamento). - REM: far partire il campionatore in modalità automatica con temperatura programmata (dopo aver precedentemente impostato i tempi di analisi e di condizionamento). CONTROLLO INTEGRATORE Al momento dell accensione (tramite un tasto posto dietro l integratore stesso) è necessario inserire, come richiesto dallo strumento, data e ora confermando con ENTER. Per effettuare un analisi gas-cromatografica è necessario conoscere i seguenti controlli: - ZERO: forza la linea di base verso sinistra. - CHT SP (CHART SPEED): imposta la velocità della carta, con valori da 0,1 a 20 cm al minuto. - ATTEN (ATTENUATION): imposta l attenuazione del segnale in ingresso. I valori sono potenze di 2 (più il valore è basso minore sarà l attenuazione e, pertanto, il picco sul cromatogramma avrà un altezza maggiore). - PT EVAL (PEAK THRESHOLD EVALUATION): consente di capire se vi è un buon rapporto segnale-rumore. Premendo PT EVAL, dopo alcuni secondi verrà stampato un valore: se questo è compreso tra 12 e 200 l analisi può partire, se invece ha un valore maggiore è necessario reimpostare la linea di base. - INJ A, INJ B: fa partire l analisi della linea A oppure della linea B; premendolo una seconda volta ferma l analisi riportando in tabella i picchi trovati e le loro aree - ABORT A, ABORT B: ferma l analisi della linea A oppure della linea B. - REPORT: alla fine dell analisi, premuto dopo ABORT, riporta in tabella i picchi trovati e le aree. - TIME: riporta l ora. - RUN TIME: riporta il tempo trascorso dall inizio dell analisi. - TFN: consente di visualizzare co precisione l inizio e la fine dei picchi. Questa funzione risulta molto utile nel caso in cui ci sono 2 picchi uniti. Per attivarla premere in sequenza i seguenti tasti: TFN, P, M, ENTER, 1, ENTER. Abbiamo riportato solo alcune funzioni dell integratore indispensabili per effettuare un analisi; tutte le altre sono consultabili sul manuale dell integratore stesso sito nel laboratorio di analisi tecniche strumentali.

9 Principio della gas-cromatografia La gas-cromatografia si basa sulla diversa ripartizione di diverse sostanze tra una fase stazionaria ed una fase mobile, in funzione dell'affinità di ogni sostanza con la fase mobile, costituita da un gas inerte. I meccanismi di separazione e le prestazioni delle numerose varianti oggi in uso della GC sono determinati non tanto dalla fase mobile, quanto dalle caratteristiche chimico-fisiche della fase stazionaria e della forma in cui essa è presente nella colonna. Questa tecnica conserva una posizione di primo piano fra le tecniche di separazione di miscele anche molto complesse, infatti è possibile analizzare campioni gassosi, liquidi o solidi, purchè siano opportunamente solubilizzato e possono essere vaporizzati. Il gas-cromatografo è praticamente indispensabile in qualsiasi laboratorio di ricerca e per il controllo di qualità in quanto può essere applicata in tutti i campi della tecnologia e della ricerca. Per classificare le tecniche gas-cromatografiche, si usano perlopiù due criteri. Uno fa riferimento allo stato fisico della fase stazionaria e distingue così fra: cromatografia gas-solido: il principio di funzionamento è l adsorbimento, in cui la fase stazionaria è un solido sulla cui superficie si trovano dei siti attivi in grado di stabilire una serie di legami secondari (dipolo-dipolo, ponte idrogeno, Van der Waals, dipolo-dipolo indotto, ecc.) con le diverse molecole della miscela da risolvere. cromatografia gas-liquido: il principio di funzionamento è ripartizione in cui la fase stazionaria è liquida nella quale si verifica una vera e propria solubilizzazione delle sostanze nella fase stazionaria che si ripartiscono tra le due fasi immiscibili. Il secondo prende in considerazione le caratteristiche geometriche della colonna e la collocazione della fase stazionaria di quest ultima; si distinguono principalmente così le seguenti varianti: - GC su colonne impaccate, in cui la fase stazionaria è formata da un solido granulare poroso o da un liquido depositato su un supporto costituito da particelle porose e inerti, che occupa tutto il volume disponibile nella colonna. Il carrier percorre la colonna passando attraverso gli spazi lasciati liberi dalle particelle di riempimento; - GC su colonne capillari, in cui la fase stazionaria viene depositata sotto forma di film sottilissimo sulle parete interne di un capillare con diametro di 0,1-0,75 mm e lungo da 15 a 100 m. Il carrier percorre il canale centrale lasciato libero dalla fase stazionaria; questo agevola il flusso del gas e consente un migliore contatto tra le due fasi.

10 Le prestazioni di un sistema cromatografico vengono valutate in base a: SELETTIVITA : è la capacità di un sistema cromatografico di eliminare specie chimiche diverse a velocità il più possibile diverse in modo che siano l una separata dall altra. EFFICIENZA: è la capacità di un sistema di eliminare tutte le particelle di una stessa sostanza con la stessa velocità in modo da vere picchi stretti. ASIMMETRIA PICCHI: una buona separazione deve fornire picchi simmetrici senza code. Le cause più probabili di asimmetria sono: 1. introduzione troppo lenta della miscela 2. adsorbimento irreversibile della sostanza sulla fase stazionaria 3. reazioni chimiche in colonna 4. sovraccarico, saturazione dei siti attivi. 5. variazione dalla Kc.

11 Tutte le separazioni cromatografiche si concludono con la registrazione del cromatogramma, ovvero del tracciato che descrive l andamento del segnale del rivelatore in funzione del tempo o del volume di eluente a partire dall istante in cui la miscela viene introdotta nella colonna. Al passaggio del solo eluente (o del gas di trasporto carrier ) il segnale è bassissimo, quindi avremo la linea di base. Al passaggio delle sostanze in esame il segnale amplificato ed il tracciato si inclina, raggiunge un massimo e ritorna alla linea di base. Ognuno di questi è detto picco cromatografico. Il suo andamento in condizioni ideali è quello di una Gaussiana. h: l altezza del picco, indica la distanza fra il punto di massimo e la tangente alla linea di base. Wb : larghezza del picco: è uguale alla lunghezza delle due tangenti ai punti di flesso. Wh : larghezza a metà altezza, è uguale alla larghezza a metà altezza del picco (50% altezza). A: indica l area totale ed è proporzionale alla concentrazione o quantità di sostanza separata. L area ABCDE corrisponde a circa il 95 % dell area del picco. T r (tempo di ritenzione): è il tempo impiegatola ciascuna sostanza per scorrere nella colonna (dall iniezione al punto di max) V r : volume di ritenzione questo valore si può misurare ed è tipico di ogni sostanza.

12 Altri parametri fondamentali sono: Tm: indica il tempo morto e corrisponde al tempo di ritenzione di una sostanza che non viene trattenuta dalla fase stazionaria. Tempo di ritenzione corretto: indica il tempo di contatto di ogni sostanza con la fase stazionaria e si calcola T 1 R= T R -T M Costante di distribuzione: durante il passaggio delle sostanze nella colonna si stabilisce un equilibrio fra fase mobile e stazionaria, se indichiamo con C la concentrazione avremo: C M C S cui corrisponde una costante di equilibrio detto anche coefficiente di distribuzione. K C = C S /C M K C dipende dalla natura della fase mobile e stazionaria ma anche dalla temperatura di lavoro (è una grandezza termodinamica). Se K C è grande, significa che C s C M quindi la sostanza è molto affine con la fase stazionaria.