Tecniche di tracciabilità genetica

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1 PAS Percorsi Abilitanti Speciali Classe di abilitazione A057 Scienza degli alimenti Tracciabilità genetica degli alimenti Tecniche di tracciabilità genetica 1

2 Tracciabilità...la capacità di risalire alla storia e all uso o alla collocazione di un prodotto o di un attività attraverso identificazioni documentate. (ISO 8402/1992)...la capacità di ricostruire e seguire il percorso di un alimento, di un mangime, di un animale destinato alla alimento mangime produzione alimentare o di una sostanza destinata o atta ad entrare a far parte di un alimento o di un mangime attraverso tutte le fasi della produzione, della trasformazione e della distribuzione. (Regolamento Europeo 178/2002)...la capacità di mantenere il controllo dell origine dei prodotti e dell identità degli animali lungo i diversi passaggi della catena alimentare, dall allevatore alla vendita al dettaglio. 2

3 Perché una tracciabilità B.S.E. Polli alla diossina Contaminazioni microbiche O.G.M. Tematiche ambientali e benessere animale Globalizzazione 3

4 Parametri di tracciabilità ampiezza: quantità delle informazioni incluse profondità: capacità di tracciare indietro/avanti in una filiera precisione: capacità di fornire informazioni (es contaminanti) costo: supportabile, automatizzabile 4

5 Tipologie di tracciabilità Tracciabilità convenzionale: sistemi di etichettature, gestione per lotti Tracciabilità geografica: individuare l origine geografica di un prodotto tramite lo studio dei composti volatili, di elementi traccia, della flora microbica Tracciabilità genetica: identificazione di organismi e loro prodotti tramite l analisi del DNA 5

6 Tracciabilità genetica Basata sul concetto che il DNA è: unico per ogni individuo; presente in ciascuna cellula dell'organismo; stabile ai trattamenti e inalterabile (quasi); facilemente isolabile e analizzabile. Identificazione individuale, di razza e di specie Precisa e profonda (tracce) 6

7 Approcci di tracciabilità genetica Differenti livelli Nuovi approcci 7

8 Tracciabilità individuale riconoscimento dell'individuo da campioni la tracciabilità genetica individuale attraverso l'intera catena alimentare è legata ad aspetti di sicurezza e salute. ogni animale (esclusi i veri gemelli) ha il proprio DNA, per cui la tracciabilità genetica dovrebbe fornire tutte le informazioni per una completa tracciabilità degli animali e dei loro prodotti, superando le limitazioni dei sistemi tradizionali ma per un sistema completo di tracciabilità i costi sono elevati profilo allelico, aplotipo: DNA fingerprinting sistemi utilizzati: 1) pannelli di marcatori microsatelliti e 2) di SNP sviluppati principalmente per test di parentela controllo della tracciabilità individuale nuove tecnologie: SNP (30-50 marker, automazione), riduzione dei costi 8

9 Tracciabilità in una filiera Se si dispone dell informazione genetica dell individuo alla nascita è possibile controllare sempre l origine dell animale e dei prodotti derivati lungo tutta la filiera. L impronta genetica è unica e COSTANTE 9

10 Tracciabilità di specie livello più alto conservazione delle specie e protezione della biodiversità presenza/sostituzione di prodotti a minor valore commerciale, specialmente in prodotti caseari, pesci e carni numerosi metodi basati sulla PCR per distinguere le specie di origine solitamente il DNA mitocondriale è preferito al DNA genomico: presente in migliaia di copie in ogni cellula (amplificazione più facile) necessità di impiegare più protocolli per coprire spettri di specie diverse alternativa: microarray per lo screening di campioni per 33 specie di pesci, uccelli e mammiferi in un test iniziativa internazionale: DNA barcoding (Consorzio per la Barcode of Life, 10

11 Tracciabilità di razza monorazza o tipici tutela e valorizzazione dei prodotti: DOP, IGP esempio classico: recupero della razza Reggiana attraverso la produzione e valorizzazione del formaggio Parmigiano Reggiano definizione classica di razza: "animali che, attraverso la selezione e l'allevamento, sono diventati simili e sono in grado di trasmettere questi caratteri (QTL) alla prole marcatori di DNA in grado di discriminare differenti razze potrebbero semplicemente basarsi sui caratteri selezionati problema: attuali razze derivano da procedure complesse di incroci e scambi di materiale genetico le razze non sono separate da barriere riproduttive e possono avere pool genetici in comune per cui è difficile identificare marcatori razza-specifici 11

12 Approcci per la tracciabilità di razza 1) approccio probabilistico basato sull'uso di microsatelliti, AFLP o SNP e analisi computazionali costituzione di banche dati di frequenze alleliche e genotipiche per ogni razza considerata es: tracciabilità dei singoli tagli di carne tecnologie di genotipizzazione ad alto rendimento basate su chip commerciali (SNP) svantaggio principale: non può essere utilizzato per assegnare la razza di origine dei prodotti costituiti da miscele di diverse / molti animali (es prodotti lattiero-caseari) 2) approccio deterministico basato sull'uso di marcatori specifici o esclusivi di razza, presenti o assenti nei prodotti analizzati può essere applicato a miscele di prodotti marcatori utili identificati guardando mutazioni nei geni che interessano le principali caratteristiche che differenziano le razze (es colore del pelo) la genetica dei colori del pelo può essere applicata per numerose specie di bestiame (bovini, suini, caprini, coniglio), ma, in molti casi, la discriminazione non è assoluta, in quanto colori simili potrebbero essere derivati da mutazioni in diversi geni o causati da effetti epistatici 12

13 Esempio di tracciabilità razza analisi delle mutazioni nel gene MC1R per l'autenticazione del Parmigiano Reggiano prodotto esclusivamente con latte di mucche di razza Reggiana caratterizzata dal colore del pelo rosso dipende dall'allele e recessivo del locus Extension / MC1R è possibile escludere frodi derivanti dalla miscela di latte ottenuto da altre razze, quali Holstein-Friesian (con alta frequenza del frequenza dell'allele dominante ED) o BrownSwiss (allele E+) non è possibile distinguere latte di mucche Simmental per l'elevata frequenza dell'allele e, ma è possibile individuare per la presenza di marcatori del pelo pezzato 13

14 Tracciabilità del sesso necessità di identificare il sesso per la qualità del prodotto (es carni bovine e di maiale) e controllo del campione in una filiera metodi di determinazione del sesso mediante PCR sequenze specifiche di DNA genomico maschile del cromosoma Y frammenti omologhi dei cromosomi sessuali più utilizzati: geni su entrambi i cromosomi sessuali, come AMELX e AMELY marcatori sesso-specifici in pannelli 14

15 Utilizzo di DNA esogeno analisi del DNA contenuto in materiale aggiunto ai prodotti non è necessario conoscere o saggiare gli animali che hanno generato i prodotti è possibile operare a diversi livelli della filiera il materiale aggiunto è di origine naturale e può essere o non può essere normalmente parte dei prodotti finali (comunque non li altera) utilizzo di piante, batteri con genomi noti metodo testato sulla catena di produzione del prosciutto crudo usando farine di frumento, derivate da linee uniche e caratterizzate geneticamente, mescolate con l'inchiostro usato per etichettare il prodotto o utilizzate per ingrassare i prosciutti il DNA del frumento è stato identificato dopo diversi mesi di stagionatura sui prosciutti mediante analisi di microsatelliti 15

16 DNA fingerpriting RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism (Van Ooijen et al., 1994; Sandbrink et al., 1995; Smulders et al., 1997); RAPD, Randomly Amplified Polymorphic DNA (Stevens et al., 1995; Grandillo and Tanksley, 1996); AFLP, Amplified Fragment Length polymorphism (Rao et al., 2009b; Rony et al., 2009); VNTR, Variable Number of Tandem Repeat, or minisatellites (Andreakis et al., 2004); SSR, Simple Sequence Repeat, or microsatellites (Smulders et al., 1997; He et al., 2003, Corrado et al., 2009); CAPS, Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (Yang et al., 2004; Caramante et al., 2009); COS, Conserved Ortholog Set (Fulton et al., 2002; Van Deynze et al., 2007; Labate et al., 2009); SNP, Single Nucleotide Polymorphism (Labate and Baldo, 2005) 16

17 Marcatori molecolari SNP: Polimorfismi a livello di un singolo nucleotide (mutazioni puntiformi), molto numerosi e distribuiti su tutto il genoma analisi veloci e automatizzabili MICROSATELLITI: Ripetizioni in tandem di corte sequenze di nucleotidi, i polimorfismi sono dovuti alle diverse ripetizioni molto numerosi e distribuiti su tutto il genoma, molto polimorfici, permettono analisi veloci AFLP, RFLP: Identificano polimorfismi in frammenti restrizione dovuti a inserzioni e delezioni. Non sono necessarie informazioni specifiche sulle sequenze del genoma 17

18 Aplotipi 18

19 Esempio: estrazione del DNA 19

20 La reazione della PCR DENATURAZIONE 94 C APPAIAMENTO 55 C Taq Taq ESTENSIONE Taq Taq 72 C

21 Amplificazione del DNA CICLI molecole bp ng 1x =4 23=8 24=16 235=3x

22 Elettroforesi in gel d agarosio - POZZETTO 800 bp GEL 300 bp + +

23 Identificazione di RFLP mediante PCR

24 Esempio1 24

25 Esempio2 25

26 Analisi AFLP 26

27 Identificazione di STR mediante PCR banda più evidente: allele bande più deboli: slippage della polimerasi

28 Analisi di microsatelliti

29 Genotipizzazione di SNP mediante ibridazione con oligonucleotidi sonda ASO (allelic specific oligonucleotide)

30 Determinazione di SNP mediante ASO (1)

31 Determinazione di SNP mediante ASO (2)

32 Determinazione di SNP mediante ASO (3)

33 Genotipizzazione con Gene Chip array sonda

34 DNA barcoding it has been demonstrated that the DNA sequence of a single mitochondrial gene (in animals) or chloroplast gene (in plants) differs among species but is very much alike in individuals of the same species As a consequence, the nucleotide sequence polymorphism of these genes could be used as a barcode, theoretically able to identify every species ( geni usati: COI, 16S 34

35 Processo di DNA barcoding 35

36 Utilizzo del DNA barcoding 36

37 Tracciabilità del pomodoro San Marzano DOP alleli SSR stabili nella catena alimentare del pomodoro profili allelici tracciano con successo cultivar di pomodoro SSR fingerprinting può evidenziare etichettature errate (corretta associazione n. registrazione e identità genetica del campione) (2010) 37

38 Tracciabilità dell'olio d'oliva Oliva (Olea europea L.): il database dei germoplasmi ( contiene 5435 accessions, in > 100 differenti collezioni discriminazione delle varietà e valorizzazione e protezione dell'olio extravergine di alta qualità tracciabilità dei cultivar mediante AFLP: 29 bande polimorfiche (2008) 38

39 Quantificazione dell'alterazione del grano Pasta: grano duro (Triticum turgidum L. Thell. subsp. turgidum convar. durum Desf. MK.); solo un massimo di 3% di grano tenero (Triticum aestivum L. Thell. subsp. vulgare Vill. MK.) (DPR Reg. 187/2001). metodi molecolari per la rivelazione di grano tenero: analisi della frazione proteica: poco stabile microsatellite specifico del genoma D 39

40 OGM Le modificazioni genetiche molte piante pochi animali esempio famoso è il salmone AquAdvantage progettato con un gene dell'ormone della crescita EnviroPig è un maiale transgenico per il gene della fitasi sotto l'azione di un promotore specifico delle ghiandole salivari in grado di digerire il fosforo contenuto nelle piante test specifici possono essere facilmente impostati utilizzando come bersaglio il gene inserito 40

41 GMO detection soglia di etichettatura, per alimenti e mangimi, non coerente 0,9% nell'ue 5% in Giappone in alcuni paesi (Russia) dipende dal tipo di prodotto prodotti alimentari, come olio, sciroppi, e amido, non richiedono etichettatura nel 2015 oltre la metà degli OGM sarà sviluppato da istituti di ricerca e non solo biotech company che avevano l'interesse di ottenere l'autorizzazione a livello mondiale: saranno possibili contaminazioni da produzioni locali fughe da prove sul campo 41

42 Metodi di tracciabilità di OGM maggior parte degli OGM vegetali prevedono l'inserimento di un DNA transgenico due tipi di metodi sono stati sviluppati per rilevare OGM: basati su proteine e DNA svantaggi dei metodi di rilevazione delle proteine: non individua direttamente la presenza del DNA instabilità delle proteine 42

43 Tracciabilità di OGM in base al DNA PCR amplificazione di uno specifico frammento (element and construct-specific methods) giunzione univoca tra transgene e genoma ospite (event-specific methods) real-time PCR microarrays PCR e capillary gel electrophoresis (fingerprinting) next generation sequencing 43

44 Cosa tracciare di un OGM 44

45 Real-time PCR la quantità di prodotto sintetizzato durante la PCR viene misurato in tempo reale dal rilevamento di un segnale fluorescente. sonda specifica fluorescente (Taqman): uso di tre oligonucleotidi: efficiente ma poco flessibile coloranti (intercalante) del DNA fluorescenti (ad esempio, SYBR Green I): necessità di confrontare curve di melting (prodotto specifico, aspecifico, dimeri) 45

46 Confronto tra PCR e real-time analisi al punto A in Pcr e realt-time: relazione lineare tra prodotto e ciclo nested PCR: maggiore sensibilità 46

47 Definizione della quantità 47

48 PCR-DDGE 48

49 Nuove necessità nella tracciabilità degli OGM l'aumento nel numero e nel tipo di OGM rende impossibile l'approccio di identificazione singola, troppo costoso non esistono metodi event-specific per OGM non autorizzati, soprattutto quelli imprevisti provenienti da prove sul campo 49

50 Nuove strategie per la tracciabilità degli OGM set minimo di test PCR (target elementi genetici, es promotori come p35s e terminatori come tnos) per trarre conclusioni sulla assenza / presenza di OGM possibili solo nei casi positivi, in una seconda fase, si identificano specificamente gli OGM presenti approccio di vaglio combinatoriale o matrixapproach : un insieme limitato di simplez real-time PCR per vari tipi di elementi (sequenze endogene, marcatori generici ed elementi GM-specifici) è selezionato in modo che più OGM siano rilevabile in un singolo saggio 50

51 CoSYPS Combinatory SYBR Green qpcr Screening Example of the use of the CoSYPS for the detection of maize GM event NK603. The following steps are performed. (1) Real-time PCR screening of the sample with the panel of markers. (2) Introduction of the results (Ct and Tm) in the CoSYPS. (3) The CoSYPS gives a list of GM events possibly present in the sample. (4) Identification of the GM events using the event-specific methods 51