Strumenti della Genetica Molecolare Umana (4)

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1 Strumenti della Genetica Molecolare Umana (4) Capitoli 6-7-8

2 SNPs La sostituzione di una base puo provocare la perdita o l insorgenza di un sito di restrizione, utilizzando PCR e digestione dell amplificato si puo rapidamente evidenziare l avvenuto cambiamento senza utilizzare il southern, il radioattivo etc bp 750bp 491bp L allele X T e X C sono distinguibili dopo digestione con TaqI. L amplificato e di 1241 bp dopo digestione se e presente la sostituzione si hanno 2 bande X C X C X C X T X C X C X C X C

3 Utilizzo degli SNPs SNPs nella regione codificante di un gene, alterando la struttura di una proteina, possono essere la causa di disordini monogenici ereditati in maniera dominante sono routinariamente usati a scopo diagnostico SNPs che alterano la struttura primaria di una proteina coinvolta nel metabolismo di un farmaco bersagli dell analisi farmacogenetica SNPs nelle regioni non-codificanti del genoma, quindi senza impatto sul fenotipo dell individuo markers usati in genetica di popolazione e negli studi di evoluzione

4 PCR allele specifica-arms (equivalente a ASO) Trova applicazione per individuare specifiche e NOTE mutazioni patogene in un sistema che nel complesso e detto ARMS, Amplification refractory mutation system) Il sitema differisce dagli ASO per la localizzazione del nucleotide rivelatore IMP. Il test ARMS puo essere inteso semplicemente come la possibilita di amplificare in modo specifico un allele, non necessariamente deve essere inteso come raffronto tra i due prodotti di PCR

5 Test per mutazioni note Ricerca di mutazioni puntiformi: ARMS (Amplification Refractory Mutation System): si eseguono 2 reazioni di PCR in parallelo IN 2 PROVETTE in una i primer sono entrambi per la sequenza normale, nell altra un primer e un ASO specifico per la mutazione. Si ha la banda di amplificazione solo se entrambi i primer si appaiano. Di solito il test e multiplex utilizzando primer che permettano di vedere piccole variazioni nella corsa elettroforetica.

6 PCR allele specifica-arms (equivalente a ASO) Mutazione NOTA (C T) in un gene voglio scoprire lo stato di eterozigosi o omozigosi dei miei samples. Costruisco tre primers: Primer forward G (finisce al 3 con una G); primer forward A (al 3 A) e un primer reverse CON (che si lega in una porzione non mutata del gene). Chiamo PCRG quella con la combinazione dei primer G-CON e PCRA quella con combinazione dei primer A-CON. Sample 1 Sample 2 Sample 3 PCRG PCRA SI SI NO NO SI SI Genotipo C/C C/T T/T IMP. Il test ARMS puo essere inteso semplicemente come la possibilita di amplificare in modo specifico un allele, non necessariamente deve essere inteso come raffronto tra i due prodotti di PCR.

7 Esempio di ARMS (multiplex) per la ricerca delle mutazioni in CF 3 pazienti (1,2,3) Primer normali APOB e OTC (controlli positivi) Primer ASO (11m.puntiformi,1ΔF508wt 1ΔF508m) In un sistema di PCR multiplex Per il paziente1: provetta A con APOB+OTC+DF508m+ 5 mutazioni m1, m2, m3, m4,m5 Per il paziente1: provetta B con APOB+OTC+DF508wt+ 6 missenso m6, m7, m8, m9, m10, m11 quali sono i primer specifici di DF508N e quali quelli di DF508M?

8 ARMS per la ricerca delle mutazioni in CF PCR con primer multipli in ogni provetta e controlli per geni non correllati a CF, l amplificato viene caricato su gel di agarosio il DNA proviene da affetti A: 5 alleli + ΔF508 Mutato +OTC +ApoB B: 6 alleli + ΔF508 Normale +OTC +ApoB ApoB Mutaz Mutaz ΔF508 OTC A B A B A B SANO 2 2 ALLELI CON MUTAZIONE PUNTIFORME 3 1 ALLELE DELETO E 1 CON MUTAZIONE PUNTIFORME

9 Microsatelliti o short tandem repeats (STRs)

10 PCR per la tipizzazione di STRs (short tandem repeats) Esempio di tipizzazione di unita C Nota: nelle cellule il sistema e instabile. Espansioni a carico di questi loci avvengono con elevata frequenza e cio comporta instabilita della regione stessa. Nell individuo troveremo cellule con un grado diverso di amplificazione

11 Microsatelliti o short tandem repeats (STRs)

12 Esempio utile per la definizione di aplotipo 12

13 Applicazioni pratiche del fingerprinting del DNA 1. Paternity and Maternity Because a person inherits his or her VNTRs from his or her parents, VNTR patterns can be used to establish paternity and maternity. The patterns are so specific that a parental VNTR pattern can be reconstructed even if only the children's VNTR patterns are known (the more children produced, the more reliable the reconstruction). Parent-child VNTR pattern analysis has been used to solve standard father-identification cases as well as more complicated cases of confirming legal nationality and, in instances of adoption, biological parenthood. 2. Criminal Identification and Forensics DNA isolated from blood, hair, skin cells, or other genetic evidence left at the scene of a crime can be compared, through VNTR patterns, with the DNA of a criminal suspect to determine guilt or innocence. VNTR patterns are also useful in establishing the identity of a homicide victim, either from DNA found as evidence or from the body itself. 3. Personal Identification The notion of using DNA fingerprints as a sort of genetic bar code to identify individuals has been discussed, but this is not likely to happen anytime in the foreseeable future. The technology required to isolate, keep on file, and then analyze millions of very specified VNTR patterns is both expensive and impractical. Social security numbers, picture ID, and other more mundane methods are much more likely to remain the prevalent ways to establish personal identification.

14 PCR per espansione di ripetizioni trinucleotidiche Sca2/+ Sca2/+ +/+ SCA2 Normale Gel di poliacrilamide Primer della regione fiancheggiante il sito di espansione in SCA2 (Atassia spinocerebellare 2) La tripletta e CAG, e in un esone ed e mutazione piena da 41 a 81 espansioni. Trasmissione: Autosomica dominante

15 60 PCR per Corea di Hungtinton (HD) Gli alleli normali arrivano fino a 29. Ci sono raramente gli intermedi fino a 35. I patologici sono oltre

16 DOP-PCR PCR ideata per rendere possibile l amplificazione di numerosi prodotti anche a sequenza nucleotidica non nota. Si puo utilizzare per amplificare l intero genoma In questo caso e nota la sequenza aminoacidica!

17 Ibridazione Cosa e un target? Cosa e un sonda e come si costruisce? Cosa e come si modifica la stringenza di un ibridazione Target e sonda (probe) possono essere frammenti di DNA, RNA o cdna oppure oligonucleotidi di sintesi Sia target che sonda devono essere resi a singola elica Come posso creare una sonda? frammento oligonucleotidico di sintesi prodotto di PCR (STS) BAC, PAC, YAC o librerie cromosomiche

18 Saggi di ibridazione: tipologie di sonde

19 Metodi ed applicazioni dell ibridazione dot-blot, gocce di DNA sono depositate sui filtri di nitro cellulosa colony hybridization, cloni batterici sono depositati sui filtri opportunamente trattati slot-blot, la deposizione del DNA e fatta mediante macchinari che depositano il DNA sui filtri passando da buchi (slot) a dimensione prefissata Sono la stessima cosa... la scelta e in relazione all economia del laborat

20 Creazione BAC libray

21 Filtri per ibridazione

22 Dove vengono conservati i cloni? 16 * 24 * 288 = clones for one library

23 Dove vengono conservati i cloni?

24 Dove vengono conservati i cloni? I freezer a -80ºC sono utilizzati per conservare le plate in cui ogni clone (in glicerolo) e separato dagli altri e facilmente identificabile dagli altri (sistema delle coordiante)

25 Creazione BAC libray... fino ai filtri

26 Filtri per ibridazione

27 Le piastre e i filtri