Variabilità genetica

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1 Variabilità genetica

2 Consiste di una sequenza di tre miliardi di questi nucleotidi Genoma L'intera sequenza del genoma umano, scritta in Times New Roman, dimensione 12, avrebbe una lunghezza di 5000 km

3 Fenotipo normale WT Wild type ceppo selvatico versione più comune di un tratto genetico nella popolazione Non sempre si può individuare WT Fatta eccezione fenotipo patologico Accoppiamento selettivo nelle piante e negli animali per aumentare o diminuire la frequenza di un carattere

4 Eugenetica Descrivere gli studi delle caratteristiche umane e applicazioni dell accoppiamento selettivo per aumentare la frequenza di alcune caratteristiche. Eugenetica: strumento politica sociale razzista CREARE UNA RAZZA PERFETTA (campagna NAZISTA ANNI 30-40)attraverso sterminio di massa degli individui inferiori Attualmente lo scopo degli studi è di lenire le sofferenze dei soggetti malati e non di migliorare la razza

5 VARIAZIONE DEI CARATTERI nel bene nel male

6 Il genoma umano contiene variazioni nella sequenza di basi tra un individuo e l altro. Sequenze codificanti Sequenze non codificanti Effetto sul fenotipo

7 Perdita di funzione Dal gene alla proteina

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12 Un esempio di mutazione non patologica

13 Mutazioni Cambi nella normale sequenza del DNA Origine: Spontanea (errori di replicazione o riparazione del DNA) Indotta (da agenti fisici o chimici) Sede: Germinali (ereditabili) Somatiche (non ereditabili)

14 Germinali Figura 2.11 Differenze nella maturazione degli spermatozoi (sinistra) e delle cellule uovo (destra). Gli spermatozoi vanno incontro a molteplici cicli di mitosi, che iniziano alla pubertà e continuano per tutta la vita adulta. Le cellule uovo, invece, completano le divisioni mitotiche durante la vita fetale.

15 Agenti mutageni

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20 Effetti delle mutazioni Mutazioni letali Provocano la morte del 100% dei portatori prima della pubertà Mutazioni subletali Portano a morte più del 50% (ma non il 100%) dei portatori prima della pubertà Mutazioni neutrali Non modificano la salute dell individuo in senso negativo o positivo Mutazioni vantaggiose Sono favorevoli per la specie, aumentando la fitness riproduttiva dei portatori Una stessa mutazione può avere effetto diverso in base all ambiente in cui il portatore vive

21 Cosa può essere colpito da una mutazione?

22 Figura 2.1 Scala delle varianti genetiche e genomiche, dal livello di un singolo nucleotide (sinistra) a variazioni nell intero cromosoma (destra).

23 Cosa può essere colpito da una mutazione? Una singola base del DNA (mutazioni puntiformi)

24 Tipi di mutazioni puntiformi Mutazioni missenso : produzione di un diverso aminoacido GAC->GAA = Asp->Glu Mutazioni sinonime : produzione di uno stesso aminoacido GGT->GGC = Ser->Ser Mutazioni non senso : formazione di un codone di stop TAT->TAA = Tyr->STOP

25 Mutazioni frameshift GAT CCG TAT CTG GTC GTA TCT Asp Arg Tyr Leu Val Val Ser G/AT CCG TAT CTG GTC GTA TCT ATC CGT ATC TGG TCG TAT CT Ile Ala Ile Trp Ser Tyr

26 Come agisce una mutazione puntiforme? Produzione di una proteina tronca (mutazione nonsenso, formazione di un codone di stop) Produzione di una proteina di sequenza diversa da quella attesa (mutazioni frameshift, da scivolamento della cornice di lettura) Produzione di una proteina di struttura diversa da quella attesa (mutazione missenso, da cambio di un aminoacido importante per la struttura tridimensionale della proteina).

27 Figura 2.4 Conseguenze di mutazioni di una singola base all interno di un esone. Se l aminoacido non è cambiato, la mutazione è silente. Le mutazioni missenso provocano la sostituzione di aminoacidi che potrà avere conseguenze sulla funzione della proteina.

28 Figura 2.3 Una mutazione nella sequenza di un promotore può portare all impossibilità di iniziare la trascrizione.

29 Figura 2.7 Vari tipi di mutazioni di splicing. Mutazioni di un sito donatore o accettore di splicing, o di un enhancer di splicing, possono portare allo skipping di un esone dall mrna a causa della fusione degli esoni fi ancheggianti. In alcuni casi la mutazione di un sito accettore o donatore porta a uno splicing aberrante di una sequenza intronica o esonica che può sostituirsi ai siti donatori o accettori. Ciò può causare la perdita di alcune sequenze esoniche o l inclusione di alcune sequenze introniche nel prodotto finale di mrna.

30 Nomenclatura

31 Cosa sappiamo oggi?

32 Progetto genoma

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36 Tratti complessi Nonostante le alte capacità di questa nuova tecnologia vanno presi in considerazione numerosi fattori che rendono ancora complessa la interpretazione delle informazioni ottenute. La complessità del nostro genoma.

37 La complessità del nostro genoma Il genoma umano contiente 4 milioni sequenze variabili del DNA(DSVs) 3.5 milioni sono singoli nucleotidi (SNVs) Migliaia di varianti strutturali inserzioni delezioni duplicazioni (SVs)(Kidd et al., 2008; Korbel et al., 2007). In ogni individuo la metà dei geni è polimorfica ( le due copie del gene non sono identiche Levy et al., 2007). genoma/exoma contiene circa 10,000 varianti non sinonime (nssnvs) che per definizione alterano la sequenza amminoacidica nella sequenzacodificante e potrebbero avere un effetto biologico (Levy et al., 2007; Ng et al., 2008; Wang et al., 2008; Wheeler et al.,

38 Progetto 1000 genomi

39 Riparazione del DNA Esistono meccanismi interni di riparazione del DNA Figura 2.13 I tre principali sistemi di riparazione del DNA. La riparazione per escissione nucleotidica rimuove un segmento di DNA intorno a una base danneggiata, e l interruzione della sequenza viene colmata utilizzando il fi lamento intatto come stampo. La riparazione per escissione di basi rimuove in primo luogo la base danneggiata, quindi i residui di zucchero e fosfato, e infine reinserisce la base corretta. Il mismatch repair corregge gli errori di incorporazione delle basi sulla catena di nuova formazione. La proteina MutS si lega al mismatch e la proteina MutL esamina il DNA per verifi care la presenza di un interruzione di sequenza adiacente. Le basi presenti tra questa interruzione e la posizione appena precedente al mismatch sono, quindi, rimosse dalla catena di nuova sintesi e sostituite utilizzando il fi lamento parentale come stampo.

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41 Figura 2.12 Due bambini affetti da xeroderma pigmentoso. Alcuni bambini, come quello sulla destra, hanno una tendenza maggiore ad avere carnagione chiara e sensibilità al sole di altri e di sviluppare lentiggini a età minore (pgc Xeroderma Pigmentosum Society).

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44 Polimorfismo genico Presenza in una popolazione di due o più alleli di un locus con una frequenza uguale o superiore a 0,01

45 Polimorfismi genici e polimorfismi del DNA: distinzione Polimorfismi genici: varianti all interno di un gene che possono o meno modificare la funzionalità dello stesso Polimorfismi del DNA Varianti in regioni esterne ai geni, che non hanno mai un ruolo funzionale

46 Polimorfismi genici Presenti in più dell 1% degli alleli di una popolazione Creano dei cosiddetti loci di suscettibilità (es. Alzheimer, Diabete non-insulino dipendente) Si trasmettono con eredità complessa, multifattoriale (intervento dell ambiente)

47 S.N.P. (Single Nucleotide polymorphisms) Presenza di un cambio di una singola base in punti specifici del genoma Possono essere presenti in regioni non codificanti ma anche all interno dei geni

48 Mutazioni Cambi nella sequenza del DNA presenti in meno dell 1% degli alleli di una popolazione Legate con rapporto causale a malattie ereditarie ad alta penetranza (Es. Fibrosi Cistica, Distrofia di Duchenne, Corea di Huntington, ecc) Trasmesse con eredità mendeliana

49 Polimorfismi Sequenza Mutazione ATTTCGCCTAA ATTTCTCCTAA Delezione ATTTCGCCTAA ATTTCCCTAA Inserzione ATTTCGCCTAA ATTTCGACCTAA Polimorfismi a singolo nucleotide (SNP)

50 APOE Presenta 3 alleli APOEe2, APOEe3, APOEe4 L allele APOEe4 è associato a un aumento di rischio di sviluppare il morbo di Alzheimer Questo rischio è relativo in particolare all età di insorgenza

51 Analisi di specifiche regioni Tutte le applicazioni della biologia molecolare utilizzate nella genetica forense sfruttano la possibilità di identificare con precisione le forme alternative di queste zone polimorfiche. Per identificare una traccia lasciata da un individuo non è necessario analizzare tutto il DNA, ma studiare solo alcune zone particolarmente variabili nella popolazione.

52 Polimorfismi di lunghezza In queste zone del DNA, particolari sequenze delle basi ACGT vengono ripetute più volte determinando nelle varie forme alleliche, lunghezze variabili del tratto medesimo. A seconda della lunghezza della sequenza ripetuta sono ulteriormente suddivisi in:

53 Polimorfismi del DNA Variazioni interindividuali della composizione o della lunghezza di specifici tratti di DNA che permettono, tramite analisi molecolare, di distinguere ciascun singolo individuo (tranne i gemelli monovulari)

54 Satelliti da 1 a diverse migliaia di basi VNTR da 9 a 100 basi Microsatelliti o STR da 1 a sei basi La classificazione attuale, utilizza dei numeri che indicano il numero delle ripetizioni presenti in ogni forma allelica

55 VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) Ripetizioni in tandem di basi di DNA all interno di specifici loci del genoma Un individuo sarà omozigote per uno specifico locus se i due alleli contengono lo stesso numero di ripetizioni, sarà eterozigote se, al contrario, il numero di ripetizioni nei due alleli è diverso Il numero di queste ripetizioni può variare da individuo a individuo, producendo dei frammenti di DNA di dimensioni diverse

56 Short Tandem Repeats (STRs) AATG 7 repeats 8 repeats the repeat region is variable between samples while the flanking regions where PCR primers bind are constant Homozygote = both alleles are the same length Heterozygote = alleles differ and can be resolved from one another

57 Short Tandem Repeats (STRs) Sono come delle impronte digitali Alto grado di polimorfismo ed alta capacità informativa Utilizzati nei paternity testing e nelle analisi forensi

58 Figura 2.21 Ripetizione di sequenza semplice. In questo caso il dinucleotide CA è ripetuto diverse volte. L allele mostrato ha sette ripetizioni diverse, ma altri alleli possono avere cinque, sei, sette, otto, nove o anche più copie della sequenza CA. Il numero di copie può essere identifi cato da un amplificazione in PCR della regione (le frecce indicano i primer della PCR fiancheggianti la sequenza di DNA) e le dimensioni dei prodotti di reazione possono essere rilevate mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide.

59 Figura 2.22 Un polimorfismo di numero variabile di ripetizioni in tandem consiste di ripetizioni multiple di un blocco di DNA. Gli alleli possono essere identificati per mezzo di una PCR che interessa l intera regione (le frecce indicano i primer di PCR).

60 Test di paternità

61 Paternity testing Madre Figlio Padre Esclusione/Non esclusione

62 tecniche

63 Figura 2.20 Diagramma della reazione di polimerizzazione acatena (PCR). I fi lamenti di DNA target sono separati (1) e i primer si legano sui due fi lamenti opposti (2). Parte quindi una reazione di sintesi del DNA che copia la sequenza target di DNA (3). Questo processo è ripetuto ciclicamente (4) e porta aun amplificazione esponenziale della sequenza target.