PNA ISH Detection Kit Codice nr. K5201

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1 PNA ISH Detection Kit Codice nr. K a edizione Per ibridazione in situ con l impiego di sonde di PNA coniugate con fluoresceina. Il kit contiene i reagenti sufficienti per almeno 40 test*. * Il numero di test si basa sull utilizzo di 25 µl di sonde e 150 µl di altri reagenti per vetrino. ( ) P04101IT_01_K / p. 1/8

2 Sommario Pagina Uso previsto... 2 Principio della procedura... 2 Reagenti A. Materiale fornito... 3 B. Materiale necessario ma non fornito... 4 C. Preparazione dei reagenti... 4 Precauzioni... 4 Conservazione... 6 Procedura di ibridazione in situ (un giorno) per la ricerca di RNA mediante sonde di PNA Reidratazione... 7 Pretrattamento... 7 Ibridazione... 7 Lavaggio di stringenza... 7 Ricerca... 7 Controcolorazione e montaggio... 7 Note sulla procedura 8 Uso previsto Per uso diagnostico in vitro. PNA ISH Detection Kit è indicato per la ricerca delle sonde di PNA (acido peptidil nucleico) coniugate con fluoresceina ibridate a RNA bersaglio in preparazioni cellulari o tissutali. Principio della procedura Il kit fornisce all utente tutti i reagenti necessari all esecuzione dell ibridazione in situ per la ricerca di RNA cellulare, fatta eccezione per la sonda di PNA specifica coniugata con fluoresceina. Su una sezione cellulare o uno striscio cellulare (forniti dall utente) una sonda di PNA (acido peptidil nucleico) coniugata a fluoresceina viene ibridata all RNA bersaglio secondo la procedura spiegata qui di seguito. All ibridazione segue un lavaggio post-ibridazione con una soluzione di lavaggio di stringenza a 55 C per 25 minuti. Successivamente, viene aggiunto un frammento anticorpale F(ab ) di coniglio coniugato con fosfatasi anti-fitc e il campione viene incubato a temperatura ambiente per 30 minuti e poi sottoposto a lavaggio. Il frammento F(ab ) consente di minimizzare il legame non specifico al campione. Dopo l aggiunta del substrato (substrato enzimatico, BCIP/NBT), il campione viene incubato a temperatura ambiente per minuti e poi sottoposto a lavaggio. Se desiderato, si può eseguire una lieve controcolorazione con ematossilina. ( ) P04101IT_01_K / p. 2/8

3 Il campione viene infine montato. Una reazione positiva viene individuata al microscopio come una colorazione blu scura-nera al sito di ibridazione. Reagenti A. Materiale fornito Fiala 1 (2 ml) Fiala 2 (0,5 ml) Fiala 3 (0,5 ml) Fiala 4 (25 ml) Fiala 5 (6 ml) Fiala 6 (6 ml) Proteinasi K (10x) Proteinasi K concentrata 10x in Tris/HCl 50 mmol/l, azide sodica 15 mmol/l, ph 7,5. Poiché la proteinasi K si autodegrada, è importante conservare la fiala 1 a 2-8 C. Sonda PNA/FITC per controllo negativo (pronta per l uso) Sonde di PNA non specifiche coniugate con fluoresceina in soluzione per ibridazione. La fiala contiene formammide al 30%. Sonda PNA/FITC per controllo positivo (pronta per l uso) Sonda di PNA coniugata con fluoresceina diretta contro gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi in soluzione per ibridazione. La fiala contiene formammide al 30%. Soluzione di lavaggio di stringenza (60x) Soluzione di lavaggio di stringenza concentrata 60x. Anti-FITC/AP (pronto per l uso) Anticorpo anti-fluoresceina coniugato con fosfatasi alcalina (F(ab ) di coniglio isolato per affinità). In tampone Tris/HCl 50 mmol/l, MgCl 2 5 mmol/l, ZnCl 2 0,25 mmol/l, BSA al 3%, stabilizzante, conservante, ph 7,5. Substrato (pronto per l uso) 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP) e tetrazolio di nitroblu (NBT). In Tris 100 mmol/l, NaCl 100 mmol/l, MgCl 2 50 mmol/l, conservante, ph 9,0. La fiala contiene N,N-dimetilformammide all 1,7%. TBS (soluzione salina di tampone Tris, ph 7,5) 3 confezioni in alluminio, ciascuna contenente 1 L di tampone, ph 7,5. Ogni confezione contiene Tris-Base 1,4 g ± 4%, Tris/HCl 6,0 g ± 4%. NaCl 8,75 g ± 4%. Dissolvere il contenuto di ciascuna confezione in 1 L di acqua pura. ( ) P04101IT_01_K / p. 3/8

4 B. Materiale necessario ma non fornito 1. Attrezzatura generica di laboratorio per procedure istologiche. 2. Attrezzatura e sonda di PNA specifica coniugata con fluoresceina per la fase di ibridazione. 3. Bagnomaria termostatato a 55 C. Per il lavaggio di stringenza, si richiede l agitazione. 4. Dako Silanized Slides, cod. n. S Dako Pen, cod. n. S2002 (facoltativa). 6. Acqua pura (p. es. acqua Milli-Q o distillata). 7. Mezzo di montaggio, Dako Faramount, cod. n. S3025, oppure Glycergel, cod. n. C0563. C. Preparazione dei reagenti Tampone TBS acqua pura. Dissolvere il contenuto di una confezione in alluminio di TBS in 1 l di Soluzione di lavaggio di stringenza (soluzione di lavoro) Diluire il volume richiesto di soluzione di lavaggio di stringenza (fiala 4) 60 volte in acqua pura e preriscaldare a 55 C a bagnomaria. Proteinasi K (soluzione di lavoro) Immediatamente prima dell uso, diluire la quantità desiderata di proteinasi K, fiala 1, 1:10 in TBS. Immediatamente dopo l uso, riportare la fiala 1 a 2-8 C (vedi Note sulla procedura, 3). Precauzioni 1. Per operatori specializzati. 2. Le fiale 2 e 3, le sonde di PNA per il controllo positivo e negativo, contengono 25-<50% formamide e 1-<3% Cloruro di sodio. Le fiale 2 e 3 sono etichettate nel modo seguente: Pericolo H319 H360 P201 P202 P281 P280 P264 P308 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 P405 P501 Provoca grave irritazione oculare. Può nuocere al feto. Procurarsi istruzioni specifiche prima dell uso. Non manipolare prima di avere letto e compreso tutte le avvertenze. Utilizzare il dispositivo di protezione individuale richiesto. Indossare guanti protettivi. Fare uso di un dispositivo di protezione degli occhi o del viso. Indossare indumenti protettivi. Lavare accuratamente le mani dopo l'uso. IN CASO di esposizione o di possibile esposizione: Richiedere assistenza medica. IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. Se l irritazione degli occhi persiste: Consultare un medico. Conservare sotto chiave. Smaltire il prodotto e il recipiente secondo ogni regolamento locale, regionale, nazionale e internazionale. ( ) P04101IT_01_K / p. 4/8

5 3. La fiala 6, il substrato, contiene 1-<3% N,N-dimetilformammide e 1-<3% trometamol. La fiala 6 è etichettata nel modo seguente: Pericolo H360 Può nuocere alla fertilità o al feto. H373 Può provocare danni agli organi in caso di esposizione prolungata o ripetuta. P201 Procurarsi istruzioni specifiche prima dell uso. P202 Non manipolare prima di avere letto e compreso tutte le avvertenze. P280 Indossare guanti protettivi. Fare uso di un dispositivo di protezione degli occhi o del viso. Indossare indumenti protettivi. P260 Non respirare il vapore. P314 In caso di malessere, consultare un medico. P308 + P313 IN CASO di esposizione o di possibile esposizione: Richiedere assistenza medica. P405 Conservare sotto chiave. P501 Smaltire il prodotto e il recipiente secondo ogni regolamento locale, regionale, nazionale e internazionale. 4. Le confezioni in alluminio di TBS (soluzione salina di tampone Tris, ph 7,5) contengono 25-<50% trometamolo e 25-<50% 2-Ammino-2-(idrossimetil)propan-1, 3-diolo, cloridrato. Le confezioni in alluminio di TBS sono etichettate nel modo seguente: H319 H315 H335 P280 Attenzione P271 P261 P264 P304 + P340 + P312 P302 + P352 + P P363 P337 + P313 P405 P501 Provoca grave irritazione oculare. Provoca irritazione cutanea. Può irritare le vie respiratorie. Indossare guanti protettivi. Fare uso di un dispositivo di protezione degli occhi o del viso. Indossare indumenti protettivi. Utilizzare soltanto all aperto o in luogo ben ventilato. Evitare di respirare il vapore. Lavare accuratamente le mani dopo l'uso. IN CASO DI INALAZIONE: Trasportare l'infortunato all aria aperta e mantenerlo a riposo in posizione che favorisca la respirazione. Contattare un CENTRO ANTIVELENI o un medico in caso di malessere. IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE: Lavare abbondantemente con acqua e sapone. Togliere gli indumenti contaminati. Lavare gli indumenti contaminati prima di indossarli nuovamente. Lavare gli indumenti contaminati prima di indossarli nuovamente. Se l irritazione degli occhi persiste, consultare un medico. Conservare sotto chiave. Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le normative locali, regionali, nazionali e internazionali. ( ) P04101IT_01_K / p. 5/8

6 5. La fiala 4, soluzione di lavaggio per stringenza, contiene trometamolo al 3,6%. Alle concentrazioni del prodotto, il trometamolo non richiede etichettature di pericolosità. Schede di sicurezza sono disponibili su richiesta per gli operatori specializzati. 6. Le fiale 1 e 5, proteinasi K e anti-fitc/ap, contengono azide sodica come conservante. L azide sodica (NaN 3 ) è una sostanza chimica altamente tossica allo stato puro. Alle concentrazioni indicate il prodotto non è classificato come pericoloso, ma l azide sodica potrebbe reagire con le tubature in piombo e in rame formando accumuli altamente esplosivi di azidi metalliche. Per lo smaltimento del prodotto, è consigliabile sciacquare abbondantemente con acqua per evitare l accumulo di azidi metalliche nelle tubature. 7. La fiala 5, anti-fitc/ap, contiene materiale di origine animale. Utilizzare le procedure di manipolazione indicate per i prodotti derivati da fonti biologiche. Conservazione I reagenti del kit devono essere conservati a 2-8 C. Le fiale 2 e 3 devono essere conservate al buio. Non usare dopo la data di scadenza indicata sulla fiala. Se i reagenti sono conservati in condizioni diverse da quelle specificate, l utente deve verificarne le condizioni. Non esistono segni evidenti che indichino l instabilità del prodotto. Per questo motivo, è necessario processare gli opportuni controlli positivi e negativi contemporaneamente ad ogni campione incognito. Se si dovesse osservare una colorazione inattesa non attribuibile a modifiche delle procedure di lavoro e si sospetta un problema relativo al prodotto, si prega di contattare il Customer Support. Poiché la proteinasi K si autodegrada, è importante conservare la fiala 1 a 2-8 C e minimizzare l esposizione a temperatura ambiente. Procedura di ibridazione in situ (un giorno) per la ricerca di RNA mediante sonde di PNA La procedura è stata messa a punto per sezioni di tessuto fissate in formalina, incluse in paraffina. I reagenti inclusi in questo kit, come anche le condizioni di ibridazione e di lavaggio, sono stati aggiustati per dare risultati ottimali con l utilizzo di sonde di PNA Dako coniugate con fluoresceina. Un controllo di tessuto positivo deve essere processato contemporaneamente ai campioni incogniti. NOTA: le incubazioni sono intese a temperatura ambiente, a meno che non sia indicato altrimenti. ( ) P04101IT_01_K / p. 6/8

7 Reidratazione Pretrattamento Ibridazione Lavaggio di stringenza Ricerca Controcolorazione e montaggio Immergere i vetrini con le sezioni tissutali in xilene Immergere in etanolo al 99% Immergere in etanolo al 96% Immergere in acqua pura. Nella vaschetta non deve essere presente RNasi (vedi Note sulla procedura, 1) Circoscrivere il campione con Dako Pen, cod. n. S2002 Immergere in acqua pura. Mettere i vetrini in una camera di umidificazione (usare guanti puliti) Immediatamente prima dell'uso, diluire la quantità desiderata di proteinasi K, fiala 1, 1:10 in TBS, p. es. versando 11 gocce di fiala 1 (o 500 µl) in 4,5 ml di TBS (vedi Note sulla procedura, 2) Aggiungere 150 µl di proteinasi K diluita a ciascuna sezione (vedi Note sulla procedura, 3). Immediatamente dopo l'uso, riportare la fiala 1 a 2-8 C Incubare Immergere i vetrini in acqua pura. Immergere i vetrini in etanolo al 96% Asciugare i vetrini all aria Aggiungere 1-2 gocce di sonda di PNA coniugata con fluoresceina alla sezione di tessuto. Su sezioni separate, aggiungere le sonde di controllo, fiale 2 e 3 Coprire le sezioni con coprioggetti Mettere i vetrini in una camera di umidificazione (per evitare la completa essiccazione delle sezioni) Mettere le camera di umidificazione in un incubatore (vedi Note sulla procedura, 4) Preriscaldare la soluzione di lavoro del lavaggio di stringenza (fiala 4 diluita 1:60) a 55 C a bagnomaria Rimuovere i coprioggetti Immergere i vetrini nella soluzione di lavoro di lavaggio di stringenza Termostatare i vetrini a temperatura ambiente immergendo brevemente in TBS Mettere i vetrini in una camera di umidificazione Aggiungere 2-3 gocce di Anti-FITC/AP (fiala 5) a ciascuna sezione Incubare Eliminare picchiettando l anticorpo Immergere i vetrini in TBS Immergere i vetrini in acqua pura. Mettere i vetrini in una camera di umidificazione Aggiungere 2-5 gocce di Substrato (fiala 6) a ciascuna sezione (vedi Note sulla procedura, 5) Incubare Eliminare picchiettando il Substrato Immergere i vetrini in acqua corrente. Controcolorare con ematossilina (se desiderato) Montare con Dako Faramount, cod. n. S3025, oppure con Glycergel, cod. n. C x 5 min 3 min min ~ 10 s ~ 5 min 1½ h a 55 C 25 min a 55 C con agitazione 10 s 30 min 2 x 1 min min 5 min 5-10 s ( ) P04101IT_01_K / p. 7/8

8 Note sulla procedura 1. Da questo punto della procedura sino a completa ibridazione è importante evitare la contaminazione delle sezioni con Rnasi. Le sezioni devono essere toccate solamente con guanti monouso puliti. L RNasi può essere completamente eliminata dalla vetreria incubando per una notte a 200 C. Altri metodi di i nattivazione dell RNasi in soluzione sono descritti nel manuale di laboratorio Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (vedi anche la sezione Precauzioni). 2. Dissolvere il contenuto di una confezione in alluminio di TBS in 1 l di acqua pura (esente da RNasi). 3. Poiché la proteinasi K si autodegrada, è importante conservare la fiala 1 a 2-8 C e minimizzare l esposizione a temperatura ambiente. La digestione proteolitica ottimale può variare fra i diversi blocchi di tessuto. Per le sezioni congelate e citospine, la proteinasi K può essere diluita più di 1:10. Si consiglia di diluire nell intervallo 1:100-1:1000, a seconda della fissazione. 4. Si è osservato che un tempo di incubazione di 1½ h assicura una sensibilità ottimale, tuttavia si possono ottenere risultati soddisfacenti diminuendo il tempo di incubazione a minuti a seconda della quantità di bersaglio presente nel campione. 5. Si è osservato che il Substrato (BCIP/NBT), fornito in PNA ISH Detection Kit, assicura massima sensibilità, tuttavia anche Dako New Fuchsin (cod. n. K0625) dà risultati molto soddisfacenti. 6. Non agitare la fiala 6 prima dell uso. Il substrato forma occasionalmente un precipitato che può alterare i risultati della colorazione se la soluzione viene agitata. Le ge nda dei simboli Nume ro di catalogo L imiti di temperatura Cod ice del lotto Fabbricante Dispositivo medico - diagnostico in vitro Tenere lont ano dalla l uce solare (consultare l a sezione sulla conservazione) Aggiungere acqua Pittogramma GHS (con sultare la sezione sulle precauzioni) Consultare le istruzio ni per l uso Conten uto sufficiente per n saggi Utilizzare entro Pittogramma GHS (con sultare la sezione sulle precauzioni) Prodotto da: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danimarca Tel Fax ( ) P04101IT_01_K / p. 8/8