rof. Giorgio Sartor Metabolismo dell azoto Copyright 2001-2012 by Giorgio Sartor. All rights reserved. Versione 1.4.2 may 2012 AD i RTEIE LISACCARIDI LIIDI AD i Aminoacidi Esosi; entosi Ac. Grassi; Glicerolo AD i AD i AD i AD i I FASE IDRLITICA AD i α-chetoacidi iruvato AcetilCoA II FASE SSIDATIVA Metabolismo dei glucidi 2 AD i III 3 2 C 2 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 2-1
AD i RTEIE LISACCARIDI LIIDI AD i Aminoacidi Esosi; entosi Ac. Grassi; Glicerolo AD i AD i AD i AD i I FASE IDRLITICA AD i α-chetoacidi iruvato AcetilCoA II FASE SSIDATIVA Metabolismo dei grassi 2 AD i III 3 2 C 2 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 3 - AD i RTEIE LISACCARIDI LIIDI AD i Aminoacidi Esosi; entosi Ac. Grassi; Glicerolo AD i AD i AD i AD i I FASE IDRLITICA AD i Metabolismo dell azoto α-chetoacidi iruvato AcetilCoA II FASE SSIDATIVA 2 AD i III 3 2 C 2 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 4-2
Metabolismo dell azoto iante superiori Aminoacidi Animali superiori itrati Batteri itriti Batteri fissatori dell azoto 2 atmosferico 3, Urea Batteri nitrificanti v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 5 - AERBISI Assimilazione del nitrato - 2 Ciclo dell azoto ITRIFICAZIE (Batteri nitrificanti) 3-2 - FISSAZIE DELL'AZT (rocarioti) 4 Azoto organico DEITRIFICAZIE (Batteri) 2 AAERBISI Respirazione del nitrato v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 6-2 3
Metabolismo dell azoto L azoto è presente nei composti organici in forma ridotta. 4 ell ambiente l azoto è presente in forma ossidata 2 3 - v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 7 - Metabolismo dell azoto Le specie ossidate vengono convertite nella specie ridotta da due diversi processi: Assimilazione del nitrato (avviene negli eucarioti fototrofi, piante verdi) 3-4 Fissazione dell azoto (avviene nei procarioti sia autonomi che simbionti di eucarioti) 2 4 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 8-4
Assimilazione del nitrato elle piante verdi (eucarioti) l assimilazione del nitrato avviene in due successivi passaggi: 2 2e - 2 itrato reduttasi Respiratoria - EC 1.7.99.4 AD - EC 1.7.1.1 AD() - EC 1.7.1.2 AD - EC 1.7.1.3 Ferredossina - EC 1.7.7.2 Cyt - EC 1.9.6.1 8 6e - 2 2 itrito reduttasi AD() - EC 1.7.1.4 Ferredossina - EC 1.7.7.1 Cyt c- EC 1.7.2.2 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 9 - itrato reduttasi La nitrato reduttasi citosolica trasferisce due elettroni dal AD al nitrato. Contiene come cofattori: FAD Cofattore molibdeno Citocromo b 577 2 S S Mo 2 2e - 2 2AD 2AD v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 10-5
itrato reduttasi v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 11 - itrato reduttasi Cofattore molibdeno Dominio catalitico v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 12-6
itrato reduttasi La nitrato reduttasi citosolica trasferisce due elettroni dal AD al nitrato. La catena di trasferimento elettronico: AD C 3 S S FAD 2 2Cyt b 577 (Fe ) Mo 4 C 3 AD 2 S FAD 2Cyt b 577 (Fe ) Mo 6 C 3 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 13 - itrito reduttasi 8 6e - 2 2 itrito reduttasi AD() - EC 1.7.1.4 Ferredossina - EC 1.7.7.1 Cyt c- EC 1.7.2.2 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 14-7
itrito reduttasi EC 1.7.1.4 La nitrito reduttasi presente nei cloroplasti agisce attraverso la ferredossina ridotta dalla fotosintesi, Il trasferimento di elettroni coinvolge un gruppo siroeme nel quale il ferro complessa lo ione nitrito che viene ridotto a ione ammonio. hυ 3 C Ferredossina (Fe ) 2-3 C Fe Fe 4 S 4 (Fe ) 2 - Fe Ferredossina (Fe ) Fe 4 S 4 (Fe ) 4 Fe v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 15 - Fissazione dell azoto Avviene nei procarioti che possono essere sia simbionti di piante superiori che avere vita autonoma Requisiti essenziali per la fissazione dell azoto: Un riducente ferredossina, EC 1.18.6.1 flavodossina, EC 1.19.6.1 Anaerobiosi Meccanismi di regolazione v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 16-8
Il complesso enzimatico della nitrogenasi Il complesso enzimatico della nitrogenasi è composta di due proteine entrambe richieste per l attività: La nitrogenasi reduttasi e La nitrogenasi La nitrogenasi reduttasi è una proteina 4Fe-4S che, legando due molecole di e una ferredossina, genera un elettrone che viene trasferito alla nitrogenasi. La nitrogenasi, catalizza la reazione: 2 2 4 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 17 - Il complesso enzimatico della nitrogenasi La nitrogenasi riduce l azoto a ione ammonio attraverso tre riduzioni successive nella quale utilizza due elettroni per volta. La riduzione avviene come: 2 2e - 2 = 2e - 2 2-2 2e - 2 2 4 2 La riduzione porta alla formazione di 2. Lo stesso enzima porta alla produzione di etilene (e etano) da acetilene, di azoto e ammonio da azide e metano e ammonio dal cianuro. In assenza di un substrato disponibile si ha la lenta produzione di 2. La ferredossina può essere rimpiazzata dalla flavodossina (EC 1.19.6.1). v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 18-9
Il complesso enzimatico della nitrogenasi Richiede la presenza di Mg Richiede nonostante che la reazione: 2 8e - 10 2 4 2 sia termodinamicamente favorita, ( G << 0), è invece elevata l energia di attivazione ( G > 0) Il sistema è fortemente inibito dall 2, ma richiede, formato da 2, gli organismi simbionti che usano la nitrogenasi operano al limite tra il poco ossigeno per evitare l inibizione e l ossigeno necessario a formare, sfruttando l emoglobina dell ospite. v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 19 - Il complesso enzimatico della nitrogenasi itrogenasi reduttasi: un enzima che opera in anaerobiosi (sensibile all 2 ), peso molecolare 60KD, contiene un centro Fe 4 S 4. hυ AD piruvato Ferredossina (Fe ) itrogenasi reduttasi (Fe ) Ferredossina (Fe ) itrogenasi reduttasi (Fe ) e - v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 20-10
Il complesso enzimatico della nitrogenasi itrogenasi EC 1.18.6.1 : un enzima Fe Mo 2 2e - Fe Fe S S Fe S Mo Fe S S Fe S Fe S S Fe 2e - 2 4e - 2 2 2 2 2 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 21 - itrogenasi Fe is Mo Fe Cys v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 22-11
Regolazione della nitrogenasi I geni per la nitrogenasi e la nitrogenasi reduttasi fanno parte di un complesso genico chiamato regulone nif. Il regulone nif comprende: i geni strutturali per il complesso della nitrogenasi, i geni per il complesso FeMo, i geni che controllano le proteine implicate nel trasporto di elettroni, diversi geni regolatori. v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 23 - Regolazione della nitrogenasi La nitrogenasi è sottoposta a una regolazione molto rigorosa. La fissazione dell'azoto è inibita da 0 2 dalla presenza di azoto combinato, 3, 0 3 e alcuni aminoacidi. La regolazione avviene soprattutto a livello della trascrizione: La trascrizione dei geni nif strutturali è e attivata dalla proteina ifa (regolazione positiva) repressa dalla proteina ifl, (regolazione negativa) v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 24-12
Regolazione della nitrogenasi Il sistema della nitrogenasi è regolato sia a livello dell attività enzimatica (feedback negativo da prodotto) che a livello dell espressione genica della nitrogenasi: Espressione di nif itrogenasi 2 10 8e - 2 4 2 16 16 i 16 AD v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 25 - itrogenasi reduttasi Il sistema della nitrogenasi è regolato anche a livello della reduttasi attraverso la formazione di un derivato AD-ribosilato: itrogenasi reduttasi ATTIVA 2 2 AD Arg 101 Arg 101 AD-ribosio AD -dinitrogenoreduttasi AD-D-ribosil transferasi EC 2.4.2.37 AD-ribosil-[dinitrogeno reduttasi] idrolasi EC 3.2.2.24 icotinamide 2 2 Gruppo AD-ribosile itrogenasi reduttasi IATTIVA 2 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 26-13
AMMI 3 4 Destino di 4 Carbamilfosfato I EC 6.3.4.16 4 2 C 3-2 Carbamilfosfato 2AD i 2 Glutamato deidrogenasi EC 1.4.1.2 EC 1.4.1.3 EC 1.4.1.4 (GD) 2 α-chetoglutarato AD AD() AD AD AD() AD 3 Glutamato Glutamina EC 6.3.1.2 (GS) 2 AD i 3 Glutamina v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 28-14
Tre enzimi 2 Carbamilfosfato I EC 6.3.4.16 1 Carbamilfosfato 2 C 3-2AD i 2 Glutamato deidrogenasi EC 1.4.1.2 EC 1.4.1.3 EC 1.4.1.4 (GD) 2 4 2 α-chetoglutarato AD AD() AD AD AD() AD 3 Glutamato Glutamina EC 6.3.1.2 (GS) 3 AD i 2 3 Glutamina v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 29 - Carbamilfosfato I (EC 6.3.4.16) Carbamilfosfato I EC 6.3.4.16 4 2 Carbamilfosfato 2 C 3-2AD i 2 Glutamato deidrogenasi EC 1.4.1.2 EC 1.4.1.3 EC 1.4.1.4 (GD) α-chetoglutarato Catalizza una delle tappe del ciclo dell urea Una molecola di attiva il bicarbonato Una molecola di fosforila il carbammato AD AD() AD AD 2 AD() Glutamina AD EC 6.3.1.2 (GS) -acetiglutamato è un attivatore allosterico 3 essenziale Glutamato 2 3 AD i 2 Glutamina C 3 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 30-15
Carbamilfosfato I (EC 6.3.4.16) AD v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 31 - Glutamato deidrogenasi (GD) (EC 1.4.1.X) È un esamero Carbamilfosfato I EC 6.3.4.16 Tre diversi enzimi che usano AD o AD o uno dei due. 2 EC 1.4.1.2 AD EC 1.4.1.3 AD() EC 1.4.1.4 Carbamilfosfato AD uò operare sia nella via biosintetica che degradativa. α-chetoglutarato AD AD AD AD GT 2 C 3-2AD i 2 Glutamato AD Glutamato deidrogenasi EC 1.4.1.2 EC 1.4.1.3 EC 1.4.1.4 (GD) 2 4 α-chetoglutarato AD AD() AD AD AD() AD 3 Glutamato Ciclo di Krebs Glutamina EC 6.3.1.2 (GS) AD i Acetil-CoA el secondo caso è attivata 2 3 allostericamente da AD e inibita da GT. Glutamina v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 32-16
Glutamato deidrogenasi (GD) (EC 1.4.1.X) v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 33 - Destino di 4 Carbamilfosfato I EC 6.3.4.16 4 2 C 3-2 Carbamilfosfato 2AD i 2 Glutamato deidrogenasi EC 1.4.1.2 EC 1.4.1.3 EC 1.4.1.4 (GD) 2 α-chetoglutarato AD AD() AD AD AD() AD 3 Glutamato Glutamina EC 6.3.1.2 (GS) 2 AD i 3 Glutamina v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 34-17
Glutamina (GS) (EC 6.3.1.2) Dodecamero Meccanismo: AD i 2 3 Glutamato 3 3 Glutamina v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 35 - Glutamina (GS) (EC 6.3.1.2) v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 36-18
Correlazione e competizione tra GD e GS Carbamilfosfato I EC 6.3.4.16 La K m per lo ione ammonio è diversa: K m (GD) > K m (GS) 2 viene consumato più in fretta di quanto la Carbamilfosfato 2 C 3-2AD i 2 la conseguenza è che ci si trova in carenza di glutamato che GD riesca a produrlo. Vi è un sistema di ripristino del glutamato a spese dell α-chetoglutarato e della glutamina. Glutamato deidrogenasi EC 1.4.1.2 EC 1.4.1.3 EC 1.4.1.4 (GD) 2 4 GD α-chetoglutarato AD AD() AD AD AD() AD 3 Glutamato Glutamina EC 6.3.1.2 (GS) 2 GS 3 Glutamina AD i v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 37 - L enzima coinvolto è la Glutamato ssoglutarato Amino Trasnsferasi (GGAT). Gli equivalanti riducenti sono diversi: 2 Carbamilfosfato I EC 6.3.4.16 AD nel lievito AD nei batteri Ferredossina ridotta nelle piante. Carbamilfosfato 2 C 3-2AD i 2 Glutamato ssoglutarato Amino Transferasi EC 1.4.7.1 (GGAT) 2 GGAT 4 α-chetoglutarato AD AD() Ferredossina ridotta 3 Glutamato Riducente ossidato Glutamina EC 6.3.1.2 (GS) 2 AD i 3 Glutamina v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 38-19
GGAT v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 39 - Regolazione allosterica della GS La glutamina è un componente centrale nella biosintesi degli aminoacidi e dei nucleotidi, La sua sintesi è estremamente regolata: In modo allosterico, da prodotti che provengono dalla glutamina, In modo covalente, Attraverso la regolazione genica. L inibizione allosterica, da prodotti, è cumulativa, mediamente ogni inibitore presente a concentrazione saturante satura l 11% dell attività. v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 40-20
Regolazione allosterica della GS Glicina Glutamato Carbamilfosfato Alanina 3 C 2 3 3 Serina 2 AM 2 2 Istidina 2 4 CT 2 Triptofano h 2 2 Glutamina AD i 3 2 Glucosamina-6-fosfato v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 41 - Regolazione covalente della GS gnuna delle dodici subunità della glutamina può essere adenilata in Tyr 397 La GS adenilata è più sensibile all inibizione cumulativa e al feeback. È un meccanismo finemente regolato, non on-off. Tyr 397 12 12 12 i 2 12 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 42-21
Regolazione covalente della GS ella regolazione covalente sono coinvolti due enzimi: Il complesso adenililtransferasi, un tetramero di 11kD che viene regolato covalentemente attraverso il legame con il gruppo uridile: IIA Uridil- IID L uridiltransferasi che catalizza la formazione di Uridil- IID Lo stato di II controlla la direzione in cui l adenilitransferasi agisce. L adenililtransferasi (nelle due forme) e l uridiltransferasi sono regolate in modo allosterico da α-chetoglutarato e glutamina. GS ATTIVA Tyr 397 deadenilata α-kg Gln 12 12 i 12 AD 4 UT 4 i Adenilil transferasi: IIA Gln Uridil transferasi α-kg Gln 4 UM 4 2 Adenilil transferasi:uridil- IID Gln α-kg 12 i GS meno ATTIVA Tyr 397 --AM v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 43 - Regolazione genica della GS Il gene che codifica per GS (GlnA) è attivato solo se uno specifico attivatore della trascrizione R I è fosforilato (R I - 3 -- ) R I i R II R II - IIA AD R I - 3 -- 2 GluA Glutamina v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 44-22
Biosintesi degli aminoacidi on tutti gli organismi viventi riescono a sintetizzare gli aminoacidi a partire dallo ione 4 : iante, batteri e lieviti: 3-4 glutamato Aminoacidi ei mammiferi: Aminoacidi essenziali: Arg, is, Ile, Leu, Lys, Met, he, Thr, Trp, Val. Aminoacidi non essenziali: Ala, Asp, Asn, Cys, Glu, Gln, Gly, ro, Ser, Tyr. v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 45 - Biosintesi degli aminoacidi Gli aminoacidi vengono, nella maggior parte dei casi, sintetizzati a partire dall α-chetoacido corrispondente attraverso una specifica aminotransferasi (transaminasi): AA 1 α-chetoacido 2 α-chetoacido 1 AA 2 Le transaminasi trasferiscono un gruppo aminico da un AA ad un α-chetoacido v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 46-23
Transaminazione Le reazione di transaminazione usano come coenzima il piridossal fosfato. Il piridossal fosfato forma una base di Shiff con un residuo di Lys della transaminasi 3 C 3 C 3 C 3 iridossina (Vit B 6 ) iridossal fosfato (L) iridossamina fosfato (M) v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 47 - Meccanismo della transaminazione (C 2 ) 4 C 3 Base di Shiff con l'enzima R 3 Aminoacido (C 2 ) 4 3 R C 3 Base di Shiff con l'aminoacido (C 2 ) 4 3 R C 3 (C 2 ) 4 3 3 C 3 R 2 α-chetoacido (C 2 ) 4 3 R C 3 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 48-24
Meccanismo della transaminazione R' R' Aminoacido 1 3 R' Aldimina (C 2 ) 4 L-enzima R' R'' 3 Chetimina Aminoacido 2 α-chetoacido R'' R' 3 Chetimina Aldimina R'' R'' R'' α-chetoacido v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 49 - Meccanismo della transaminazione AA 1 R' Aminoacido 1 3 R' R' L legato alla Lys (C 2 ) 4 R' R'' 3 AA 2 Aminoacido 2 R'' α-chetoacido 1 R' αka 1 3 L legato allo ione ammonio R'' R'' R'' αka 2 α-chetoacido 2 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 50-25
Biosintesi degli aminoacidi Gli aminoacidi possono essere raggruppati in base agli intermedi dai quali provengono: Famiglia dell α-chetoglutarato: Glu, Gln, ro, Arg, Lys. Famiglia dell aspartato: Asp, Asn, Met, Thr, Ile, Lys. Famiglia del fosfoenolpiruvato e dell eritrosio-4-fosfato: he, Tyr, Trp Famiglia del piruvato: Ala, Val, Leu Famiglia del 3-fosfoglicerato: Ser, Gly, Cys Dal fosforibosilpirofosfato: is v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 51 - Degradazione degli aminoacidi A differenza degli acidi e grassi e dei glucidi gli aminoacidi in eccesso non possono né essere immagazzinati in macromolecole di deposito né essere escreti come tali, vengono quindi demoliti. roteine roteolisi Aminoacidi Acetil-CoA Acetoacetil- CoA iruvato Intermedi ciclo di Krebs Catena carboniosa Liasi (deaminasi) Acidi grassi Corpi chetonici Glucoso 4 Urea 3 Altri composti azotati semplici v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 52-26
roteolisi Idrolisi del legame peptidico ell intestino dell uomo sono presenti diverse proteasi secrete da diversi organi digestivi: Dallo stomaco: pepsina Dal pancreas: chimotripsina e tripsina Dall intestino tenue: peptidasi intestinali (leucina aminopeptidasi. v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 53 - epsina Secreta dalle cellule della mucosa gastrica (che secernono anche Cl) come pepsinogeno inattivo (40 kd): epsinogeno p acido epsina -42AA -AA-AA-AA-AA- AA AA-AA AA-AA-AA Taglia con maggior frequenza legami tra aminoacidi aromatici, Met, Leu e produce peptidi e pochi aminoacidi liberi. v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 54-27
Chimotripsina e tripsina Chimotripsinogeno Tripsinogeno Enterochinasi Chimotripsina 2 peptidi Tripsina peptide 6 AA -terminale Arg Lys Trp Tyr he R R v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 55 - eptidasi intestinali rocarbossipeptidasi A e B Carbossipeptidasi A B Leucina aminopetidasi R Lys Arg R 3 Leu R v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 56-28
v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 57 - ssidazione degli aminoacidi La degradazione degli aminoacidi è un processo complesso che coinvolge un numero molto grande di intermedi: Ala Ser Cys Gly Thr Trp iruvato Ile Leu Thr Trp C 2 Catena Carboniosa Glucoso Acetil-CoA Acetoacetato Azoto ammoniacale: Urea 3 Azoto basi azotate: Acido urico Urea 3 Asp he Tyr Asn Asp Ile Met Val ssalacetato Fumarato Succinil-CoA KREBS C 2 Citrato Isocitrato C 2 α-chetoglutarato Leu Lys he Tyr Arg Gln Glu ro is v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 58-29
Azoto Il primo stadio della degradazione degli aminoacidi è la rimozione del gruppo amminico attraverso le aminotransferasi: AA 1 α-chetoacido 2 α-chetoacido 1 AA 2 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 59 - Asp 3 Azoto ssalacetato Ala Leu 3 C C 3 3 C3 3 α-chetoglutarato Glu 3 3 C C 3 iruvato C3 α-chetoisocaproato Tyr 3 p-idrossifenilpiruvato v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 60-30
Asp 3 Azoto ssalacetato Ala Leu 3 C C 3 3 C3 3 α-chetoglutarato Glu 3 3 C C 3 C3 iruvato α-chetoisocaproato Tyr 3 p-idrossifenilpiruvato v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 61 - Transaminazione Le reazione di transaminazione usano come coenzima il piridossal fosfato. Il piridossal fosfato forma una base di Shiff con un residuo di Lys della transaminasi (EC 2.6.1.X, uno per ogni aminoacido). 3 C 3 C 3 C 3 iridossina (Vit B 6 ) iridossal fosfato (L) iridossamina fosfato (M) v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 62-31
Meccanismo della transaminazione (C 2 ) 4 C 3 Base di Shiff con l'enzima R 3 Aminoacido (C 2 ) 4 3 R C 3 Base di Shiff con l'aminoacido (C 2 ) 4 3 R C 3 (C 2 ) 4 3 3 C 3 R 2 α-chetoacido (C 2 ) 4 3 R C 3 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 63 - Meccanismo della transaminazione R' R' Aminoacido 1 3 R' Aldimina (C 2 ) 4 L-enzima R' R'' 3 Chetimina Aminoacido 2 α-chetoacido R'' R' 3 Chetimina Aldimina R'' R'' R'' α-chetoacido v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 64-32
Meccanismo della transaminazione AA 1 R' Aminoacido 1 3 R' R' L legato alla Lys (C 2 ) 4 R' R'' 3 AA 2 Aminoacido 2 R'' α-chetoacido 1 R' αkg 1 3 L legato allo ione ammonio R'' R'' R'' αkg 2 α-chetoacido 2 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 65 - Meccanismo della transaminazione Lys 258 2 δ 2 Arg 266 α-elica dipolo Il L è legato alla Lys come base di Shiff δ Asp 222 C 3 Tyr 225 Tasca idrofobica v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 66-33
Meccanismo della transaminazione Arg 2 2 2 Arg 266 2 δ α-elica dipolo δ Arg 2 2 Asp 222 Lys 258 C 3 Tyr 225 Tasca idrofobica Intermedio tetraedrico Si lega l AA, la molecola è tenuta in sede da due Arg che danno la specificità v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 67 - α-chetoacido Meccanismo della transaminazione Arg 2 2 Arg 2 2 2 2 δ 3 3 C 3 Lys 258 Tyr 225 iridossamina Arg 266 Tasca idrofobica α-elica dipolo δ Asp 222 Si forma l α-chetoacido e la piridossamina. v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 68-34
Meccanismo della transaminazione Lys 258 Arg 266 Asp 222 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 69 - L Il L è un sistema molto versatile per trasformare aminoacidi: Il legame C- (A) è reso più labile nelle transaminasi Il legame C-C - (B) è reso più labile nelle decarbossilasi Il legame C-R (C) è reso più labile nelle aldolasi Gli enzimi con L catalizzano anche reazioni al Cβ e Cγ. (C) R (A) (B) C 3 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 70-35
Metabolismo dell azoto Ciclo dell urea Eliminazione dell azoto La forma molecolare con la quale viene eliminato da un organismo dipende dalla disponibilità di acqua: Ammonio: Ammoniotelici Invertebrati acquatici Urea: Ureotelici esci, anfibi, bivalvi di acqua dolce Acido allantoico Alcuni teleostei Allantoina Molluschi, insetti, mammferi (non primati) Acido Urico: Uricotelici Insetti, vermi, rettili, uccelli, primati. 2 2 4 Disponibilità di acqua 2 2 2 Ammonio Urea Acido allantoico Allantoina Acido urico URIE v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 72-36
Eliminazione dell azoto v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 73 - Ciclo dell urea 2 2AD i Carbamilfosfato C 2 3 2 Carbamil-fosfato EC 6.3.4.16 3 Citrullina (I) 2 3 3 rnitina (I) 3 2 2 3 Arginasi EC 3.5.3.1 2 Arginina Trasportatore dell'ornitina rnitina (UT) 2 2 Urea rnitina trans carbamilasi EC 2.1.3.3 Fumarato 3 liasi EC 4.3.2.1 Citrullina (UT) Aspartato 3 3 AM 3 EC 6.3.4.5 EC 6.3.4.5 Trasportatore della citrullina 2 3 2 i 2 i 2 Citrullil-AM 2 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 74-37
Ciclo dell urea 2 2AD i Carbamilfosfato C 2 3 2 Carbamil-fosfato EC 6.3.4.16 3 Citrullina (I) 2 3 3 rnitina (I) 3 2 2 2 Arginina 3 Arginasi EC 3.5.3.1 rnitina (UT) 2 2 Trasportatore dell'ornitina Urea rnitina trans carbamilasi EC 2.1.3.3 Malato Fumarato 3 ssalacetato liasi EC 4.3.2.1 α-chetoacido Aminoacido Citrullina (UT) Aspartato 3 3 AM 3 EC 6.3.4.5 EC 6.3.4.5 Trasportatore della citrullina 2 3 2 i 2 i 2 Citrullil-AM 2 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 75 - Ciclo dell urea 2 2AD i Carbamilfosfato C 2 3 2 Carbamil-fosfato EC 6.3.4.16 3 Citrullina (I) 2 3 3 3 La carbamil-fosfato catalizza la reazione di Citrullina (UT) 2 2 i formazione di carbamil-fosfato da C 2 e 3. 2 Trasportatore dell'ornitina i Intervengono due molecole di, 3 rnitina EC 6.3.4.5 3 (UT) L enzima deve 2 essere attivato da un effettore allosterico, il Aspartato Urea -Acetilglutamato. 3 2 Arginasi 2 EC 3.5.3.1 3 Questo derivato proviene da acetil-coa e glutamato Citrullil-AM 2 quando la concentrazione Fumarato dei quest ultimo è alta, segnale 3 di un eccesso di 2 aminoacidi liberi. EC 6.3.4.5 Arginina rnitina (I) 2 rnitina trans carbamilasi EC 2.1.3.3 liasi EC 4.3.2.1 3 AM Trasportatore della citrullina 2 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 76-38
Ciclo dell urea Bicarbonato AD Carbonil-fosfato i 2 Carbammato AD 2 Carbamilfosfato Le due molecole di operano in questo modo: la prima attiva in carbonato (C 2 ) per formare il carbonilfosfato, L ammoniaca si lega e forma il carbammato liberando il fosfato, La seconda molecola di lega il carbammato attivandolo. v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 77 - Ciclo dell urea 2 2AD i Carbamilfosfato C 2 3 2 Carbamil-fosfato EC 6.3.4.16 3 Citrullina (I) 2 3 3 rnitina (I) 3 2 2 2 3 Arginasi EC 3.5.3.1 Arginina rnitina (UT) 2 2 Trasportatore dell'ornitina Urea rnitina trans carbamilasi EC 2.1.3.3 Fumarato 3 liasi EC 4.3.2.1 3 Citrullina (UT) 2 2 i 2 Il carbamil-fosfato si lega i all ornitina per formare la EC 6.3.4.5 citrullina. Aspartato 3 Queste due reazioni 2 avvengono 3 nella matrice Citrullil-AM mitocondriale dove l ornitina EC 6.3.4.5 AM trasportatore specifico 3 Trasportatore della citrullina è stata trasportata da un 2 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 78-39
2 2AD i La citrullina viene C 2 3 2 Carbamil-fosfato trasportata fuori EC 6.3.4.16 dalla 3 matrice mitocondriale rnitina da (I) rnitina trans carbamilasi 3 EC 2.1.3.3 un trasportatore specifico e, nel citoplasma, si combina con l aspartato per dare Trasportatore dell'ornitina l argininosuccinato. 3 rnitina 3 (UT) L enzima responsabile è 2 Urea l argininosuccinato 2 che catalizza Arginasi EC 3.5.3.1 prima la formazione del 2 Fumarato Citrullil-AM 3 a spese di 2 e quindi il legame 2 Arginina con l aspartato. Ciclo dell urea Carbamilfosfato 3 liasi EC 4.3.2.1 Citrullina (I) 2 Citrullina (UT) Aspartato 3 3 AM 3 EC 6.3.4.5 EC 6.3.4.5 Trasportatore della citrullina 2 3 2 i 2 i 2 Citrullil-AM 2 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 79 - Ciclo dell urea 2 2AD i Carbamilfosfato C 2 3 2 Carbamil-fosfato EC 6.3.4.16 3 Citrullina (I) 2 3 3 3 Citrullina (UT) 2 2 i 2 Trasportatore dell'ornitina i 3 rnitina EC 6.3.4.5 3 Una liasi ( (UT) liasi) promuove la scissione 2 Aspartato dell arginino siccinato Urea in fumarato e arginina. 3 2 Arginasi L arginina 2 EC è3.5.3.1 anche precursore dell ossido 3 di azoto (). Citrullil-AM 2 Fumarato 3 2 EC 6.3.4.5 Arginina rnitina (I) 2 rnitina trans carbamilasi EC 2.1.3.3 liasi EC 4.3.2.1 3 AM Trasportatore della citrullina 2 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 80-40
Ciclo dell urea 2 2AD i Citrullina Carbamilfosfato (I) Il fumarato C 2 3 può venire riciclato 2 ad aspartato attraverso la Carbamil-fosfato 2 formazione di malato e ossalacetato, EC 6.3.4.16 3 queste trasformazioni sono catalizzate 3 da isoenzimi citosolici rnitina Trasportatore (I) rnitina della citrullina di analoghi enzimi del trans carbamilasi ciclo di Krebs (mitocondriali). 3 EC 2.1.3.3 Le transaminasi si occupano poi di convertire 3 l ossalacetato in aspartato che viene riutilizzato nella Citrullina tappa precedente. (UT) 2 2 i 2 Trasportatore dell'ornitina α-chetoacido Aminoacido i 3 rnitina EC 6.3.4.5 3 ssalacetato (UT) 3 2 2 Arginasi EC 3.5.3.1 2 Arginina 2 2 Urea Malato Fumarato liasi EC 4.3.2.1 Aspartato 3 3 AM EC 6.3.4.5 2 3 2 Citrullil-AM v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 81 - Ciclo dell urea 2 2AD i Carbamilfosfato C 2 3 2 Carbamil-fosfato EC 6.3.4.16 3 Citrullina (I) 2 3 3 rnitina (I) 3 2 2 3 Arginasi EC 3.5.3.1 2 Arginina 2 2 Trasportatore dell'ornitina rnitina (UT) Urea rnitina trans carbamilasi EC 2.1.3.3 Fumarato 3 Citrullina (UT) 3 AM 3 Aspartato L arginina viene infine 3 convertita in ornitina (UT) 2 3 Citrullil-AM liasi EC 4.3.2.1 EC 6.3.4.5 EC 6.3.4.5 Trasportatore della citrullina 2 2 e Urea da una arginasi. i 2 i 2 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 82-41
Ciclo dell urea 2 2AD i Carbamilfosfato C 2 3 2 Carbamil-fosfato EC 6.3.4.16 3 Citrullina (I) 2 3 3 rnitina (I) 3 2 2 2 3 Arginasi EC 3.5.3.1 Arginina rnitina (UT) 2 2 Trasportatore dell'ornitina Urea rnitina trans carbamilasi EC 2.1.3.3 Malato Fumarato 3 liasi EC 4.3.2.1 α-chetoacido Aminoacido ssalacetato Citrullina (UT) Aspartato 3 3 AM 3 EC 6.3.4.5 EC 6.3.4.5 Trasportatore della citrullina 2 3 2 i 2 i 2 Citrullil-AM 2 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 83 - Ciclo dell urea e 2 2AD i Carbamilfosfato C 2 3 2 Carbamil-fosfato EC 6.3.4.16 3 Citrullina (I) 2 Urea 2 2 Trasportatore dell'ornitina rnitina (UT) 3 Arginasi EC 3.5.3.1 2 3 3 Arginina rnitina (I) 3 2 2 3 3 0.5 AD 2 EC 1.14.13.39 -ϖ-idrossi-l-arginina 2 AD rnitina trans carbamilasi EC 2.1.3.3 2 AD Malato Fumarato ssalacetato α-chetoacido liasi EC 4.3.2.1 2 Aminoacido 2 0.5 AD. Aspartato 3 3 AM 3 EC 6.3.4.5 EC 6.3.4.5 Trasportatore della citrullina 2 3 Citrullina (UT) 2 i 2 i 2 Citrullil-AM 2 v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 84-42
Catena carboniosa Ala Ser Cys Gly Thr Trp iruvato Ile Leu Thr Trp C 2 Glucoso Acetil-CoA Acetoacetato Asn Asp ssalacetato Citrato Leu Lys he Tyr Asp he Tyr Ile Met Val Fumarato Succinil-CoA KREBS C 2 Isocitrato C 2 α-chetoglutarato Arg Gln Glu ro is v. 1.4.2 gsartor 2001-2012 Metabolismo dell'azoto - 85 - Crediti e autorizzazioni all utilizzo Questo materiale è stato assemblato da informazioni raccolte dai seguenti testi di Biochimica: CAME amela, ARVEY Richard, FERRIER Denise R. LE BASI DELLA BICIMICA [ISB 978-8808-17030-9] Zanichelli ELS David L., CX Michael M. I RICII DI BICIMICA DI LEIGER - Zanichelli GARRETT Reginald., GRISAM Charles M. BICIMICA con aspetti molecolari della Biologia cellulare - Zanichelli VET Donald, VET Judith G, RATT Charlotte W FDAMETI DI BICIMICA [ISB 978-8808-06879-8] - Zanichelli E dalla consultazione di svariate risorse in rete, tra le quali: Kegg: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes http://www.genome.ad.jp/kegg/ Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/ rotein Data Bank: http://www.rcsb.org/pdb/ Rensselaer olytechnic Institute: http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/mbweb/mb1/mb1index.html Il materiale è stato inoltre rivisto e corretto dalla rof. Giancarla rlandini dell Università di arma alla quale va il mio sentito ringraziamento. Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da: http://www.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/ oppure da http://www. gsartor.org/ Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto l autore usando questa frase: Materiale ottenuto dal rof. Giorgio Sartor Università di Bologna a Ravenna Giorgio Sartor - giorgio.sartor@unibo.it 43