RIDASCREEN Art. R5701. Verotoxin. Saggio immunoenzimatico per la rilevazione delle Verotossine 1 e 2. Test in vitro Conservare a 2-8 C

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1 RIDASCREEN Art. R5701 Verotoxin Saggio immunoenzimatico per la rilevazione delle Verotossine 1 e 2 Test in vitro Conservare a 2-8 C

2 Prodotto da: R-Biopharm AG An der neuen Bergstraße 17 D Darmstadt Per informazioni: Telefono: Centralino ( ) Telefax / Ordini ( ) orders@r-biopharm.de Marketing ( ) info@r-biopharm.de Distribuito da: R-Biopharm Italia Srl Via Morandi, Melegnano (MI) Telefono info@r-biopharm.it - RIDA e RIDASCREEN sono marchi registrati della R-BIOPHARM AG Produttore: R-BIOPHARM AG, Darmstadt, Germania R-BIOPHARM AG è certificata ISO RIDASCREEN Verotoxin

3 RIDASCREEN Verotoxin Introduzione RIDASCREEN Verotoxin (Art. No.: R5701) è un saggio immunoenzimatico a sandwich per la rilevazione delle Verotossine 1 e 2 (SLT-I e SLT-II) da coltura di arricchimento. Tutti i reagenti richiesti per l analisi immunoenzimatica compreso un controllo positive sono contenuti nel kit. Il kit è sufficiente per 96 determinazioni (incluso il controllo positivo). Per la quantificazione è necessario un lettore per micropiastre. Preparazione campioni: Tempo necessario: Limite di rilevabilità: Cross-reazioni: dopo l arricchimento e la centrifugazione del campione, il surnatante della coltura viene utilizzato direttamente nel saggio preparazione campione pre-arricchimento... 6 ore arricchimento per una notte ore esecuzione del test (incubazione)... 1 ora 45 min l arricchimento per ore è sufficiente ad individuare le tossine nel surnatante della coltura non si individuano cross-reazioni oltre alla rilevazione specifica di SLT-I e SLT-II La specificità del kit RIDASCREEN Verotoxin è stata determinata analizzando le cross-reattività ai corrispondenti organismi non-bersaglio in colture pure (vedi paragrafo 13, Specificità ). Nei campioni, la specificità può differire da quanto determinato in una coltura pura a causa della presenza naturale di batteri. Durante l analisi di campioni contenenti naturalmente batteri, l utente deve tenere in considerazione la conformità alle normative riguardanti il pre-arricchimento selettivo dei campioni. Il test non è in grado di discriminare tra organismi bersaglio e organismi non bersaglio cross-reattivi. RIDASCREEN Verotoxin

4 Al fine di aumentare la qualità della valutazione durante l esecuzione di metodi ELISA, è disponibile la nostra guida Good ELISA Practice (GEP) che elenca gli standard minimi e le procedure concernenti le condizioni generali di utilizzo dei kit per analisi di R-Biopharm AG e di esecuzione dei test ELISA. Il manuale può essere recuperato, stampato e scaricato dal sito web Prodotti correlati: RIDA Enrichment broth (100 provette)... (Z1000) RIDA Enrichment broth (25 provette)... (Z1003) 1. Scopo RIDASCREEN Verotoxin è un analisi immunoenzimatica per la rilevazione delle Verotossine 1 e 2 (SLT-I e SLT-II) in una coltura di arricchimento. 2. Generale Le Enterobacteriaceae della specie Escherichia coli (E. coli) sono commensali della flora intestinale dell individuo sano e anche di molti animali da allevamento, e quindi indicatori della contaminazione fecale delle acque e degli alimenti. A causa di diversi fattori di patogenicità, spesso legati a plasmidi o trasmessi tramite fagi, E. coli sono considerati come patogeni facoltativi. A partire dal 1977, sono stati individuati ceppi di E. coli in grado di produrre due citotossine, le Verotossine 1 e 2. A causa delle loro somiglianze con la tossina Shiga di Shigella dysenteriae, le Verotossine sono denominate anche tossine Shiga-like 1 e 2 (SLT I e II). Il prototipo dei ceppi di E. coli enteroemorragico (EHEC) fu descritto per la prima volta nel I sintomi clinici riferibili a EHEC vanno dalla gastroenterite lieve a quella grave,fino alla colite emorragica che è responsabile del 10-20% di tutte le infezioni. Possono inoltre verificarsi complicazioni post-infettive e situazioni di pericolo di vita nel 5-10 % dei casi. Sono colpiti specialmente i neonati e i bambini della prima infanzia, ma anche gli anziani e i pazienti immunocompromessi. Grazie alla sua elevata resistenza ambientale e alla relativa tolleranza acida, il livello di infezione da EHEC è solo di circa 10² microbi. Le principali fonti di infezione sono i prodotti a base di carne bovina, ovina e caprina, specialmente se la carne è cruda oppure cotta in maniera insufficiente o se è mal conservata, e il latte crudo. Particolarmente importanti sono le catene infettive, 4 RIDASCREEN Verotoxin

5 specialmente se si sviluppano in strutture pubbliche quali gli asili, gli istituti per gli anziani o gli ospedali, e i contatti diretti con gli animali. La procedura attualmente raccomandata per l analisi di prodotti alimentari prevede un pre-arricchimento del patogeno per 6 ore, l inoculo di una certa aliquota del pre-arricchimento in un nuovo brodo e la successiva incubazione per tutta la notte (16-18 h). Dopo tale procedura i batteri dovrebbero essere stati isolati. Nello stesso tempo, utilizzando il brodo di arricchimento, è possibile eseguire la rilevazione delle verotossine, il più sicuro fattore di patogenicità. Questa può essere svolta mediante PCR o mediante analisi immunologiche in ELISA. Rispetto alla PCR, le tecniche ELISA, quali ad esempio RIDASCREEN Verotoxin, sono metodi semplici e possono essere eseguiti in qualsiasi laboratorio. Una procedura di arricchimento è richiesta per entrambi i metodi dal momento che l escrezione dei germi, nonchè il contenuto di tossina negli alimenti, può essere molto basso. 3. Principio del test Il test si basa su una reazione antigene-anticorpo. Gli anticorpi monoclonali contro le Verotossine 1 e 2 sono legati sulla superficie dei pozzetti della micropiastra. Vengono poi aggiunti i controlli, le soluzioni dei campioni ed il coniugato 1 (anticospo specifico per le verotossine). Dopo una fase di lavaggio, viene aggiunto e incubato a temperatura ambiente il coniugato 2 (anticorpi monoclonali legati a perossidasi). Se è presente la verorossina, si forma un complesso a sandwich. Il coniugato non legato viene eliminato con un lavaggio. Nei pozzetti viene aggiunta e incubata la soluzione substrato/ cromogeno. Il coniugato legato all enzima converte il cromogeno incolore in un prodotto blu. L aggiunta della soluzione di stop provoca un viraggio del colore dal blu al giallo. La determinazione quantitativa è eseguita fotometricamente a 450 nm (utilizzando un filtro di riferimento a 620 nm). I valori di assorbanza sono direttamente proporzionali alla concentrazione di Verotossina nel campione. RIDASCREEN Verotoxin

6 4. Reagenti forniti Ogni kit contiene materiale sufficiente per 96 determinazioni (incluso un controllo positivo). Ciascun kit contiene: Componente Colore del tappo Formato Quantità Micropiastra - Pronto all uso 96 pozzetti Positive control Rosso Pronto all uso 2 ml Negative control Bianco Pronto all uso 2 ml Wash buffer Marrone Concentrato 10x 100 ml Conjugate 1 Arancione Pronto all uso 13 ml Conjugate 2 Bianco Pronto all uso 13 ml Substrate/Chromogen Blu Pronto all uso 13 ml Stop solution Giallo Pronto all uso 14 ml 5. Materiale richiesto ma non fornito 5.1. Attrezzatura spettrofotometro per micropiastra (450 nm/620 nm) beute sterili da 500 ml, agitatore micropipette a volume variabile 20 µl µl e µl 5.2. Reagenti terreno per il pre-arricchimento: Tryptic-Soy-Broth modificato (mtsb) con Novobiocina Composizione: 17 g/l Triptone, 3 g/l Soitone, 5 g/l NaCl, 4 g/l K 2 HPO 4, 2.5 g/l Glucosio, 1.5 g/l Sali biliari No. 3 integrato con 10 mg/l Novobiocina (concentrazione finale) terreno per l arricchimento: brodo mtsb con supplemento (mitomicina C) Composizione: mtsb (vedi sopra) integrato con 50 µg/l Mitomycin C (concentrazione finale) Per l arricchimento è possibile utilizzare il brodo pronto all uso RIDA Enrichment broth (Art. No. Z1000 e Z1003). Il terreno contenente mitomicina C, deve essere smaltito secondo le comuni disposizioni valide per le sostanze pericolose o secondo le speicifiche informazioni date dal produttore. 6 RIDASCREEN Verotoxin

7 Alcuni suggerimenti sullo smaltimento sono inclusi nel manuale del RIDA Enrichment broth (Art. No. Z1000 e Z1003). 6. Avvertenze e precauzioni per gli utilizzatori Il test deve essere eseguito da personale di laboratorio qualificato. Le istruzioni per l uso devo essere seguite scrupolosamente. Tutti i campioni devono essere trattati come materiale potenzialmente infetto. Tutti i materiali e i reagenti che vengono a contatto con campioni potenzialmente infetti devono essere trattati con disinfettanti o sterilizzati in autoclave a 121 C (250 F) per almeno 1 ora. Il kit può contenere sostanze pericolose. Per ulteriori informazioni sulla sostanze contenute, far riferimento alla scheda di sicurezza (MSDS) scaricabile direttamente online al sito 7. Istruzioni per la conservazione Conservare il kit a 2-8 C (36-46 F). Non congelare alcun componente del kit. Riporre i pozzetti non utilizzati nella busta originale richiuderli insieme all essiccante fornito e conservare a 2-8 C (35-46 F). La soluzione substrato/cromogeno incolore è fotosensibile, pertanto evitare di esporla a luce diretta. Non utilizzare il kit oltre la data di scadenza indicata sulla confezione. Il kit può essere utilizzato regolarmente fino alla data di scadenza (indicata sulla confezione), se conservato correttamente. Non scambiare singoli reagenti appartenenti a kit con diverso numero di lotto. 8. Indicazioni di instabilità o deterioramento dei reagenti Qualsiasi colorazione bluastra della soluzione substrato/cromogeno prima dell analisi Un valore inferiore a 0.8 unità di assorbanza (A 450/620nm < 0.8) per il controllo positivo RIDASCREEN Verotoxin

8 9. Preparazione dei campioni Per la rilevazione delle verorossine prodotte da E. coli con il kit RIDASCREEN Verotoxin fino ad un limite di 1 CFU/25 g di campione alimentare, è necessario eseguire prima una procedura di pre-arricchimento della durata di 6 ore a 37 C (98.6 F). Si raccomanda pertanto l uso di mtsb integrato con Novobiocina (secondo la direttiva tedesca Raccolta ufficiale di metodi analitici; 64 LFGB ). Per ottenere una sensibilità sufficiente, è consigliabile quantificare la tossina dopo un secondo arricchimento colturale. Si raccomanda a tal fine di effettuare un arricchimento di una notte in terreno mtsb a 37 C (98.6 F) (vedi 5.2.), agitando la coltura. Per l induzione delle verotossine prodotte da E. coli si raccomanda l aggiunta di mitomicina C (50 µg/l) al terreno. omogeneizzare 25 g di campione in 225 ml di mtsb (contenente Novobiocina) pre-riscaldato a 37 C (98.6 F), incubare per 6 ore a 37 C (98.6 F) in agitatore aggiungere 1ml del brodo di pre-arricchimento a 4 ml di mtsb + mitomicina C oppure aggiungere il contenuto di una provetta di RIDA Enrichment broth (Art. No. Z1000 e Z1003, par. 5.2) ed incubare per una notte (16-18 h) a 37 C (98.6 F) in agitatore trasferire la coltura in una provetta da centrifuga centrifugare per 10 min, 3500 g, temperatura ambiente (20-25 C / F) nel saggio utilizzare 100 µl per ogni pozzetto 10. Esecuzione del test Indicazioni preliminari Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (20-25 C / F) prima dell uso. Il tampone di lavaggio è fornito concentrato 10 volte. Prima di procedere alla diluizione, disciogliere completamente con un bagno termostatico i cristalli che inevitabilmente si formano. Diluire quindi il tampone concentrato 1:10 (1+9) con acqua distillata (ad es. 100 ml di concentrato ml di acqua distillata) prima dell uso. Una volta diluito, il tampone resta stabile a 2-8 C (35-46 F) per ca. quattro settimane. 8 RIDASCREEN Verotoxin

9 10.2. Procedura del test Per ciascun test eseguire in duplicato sia il controllo positivo contenuto nel kit che il controllo negativo. Attenzione: Tutti i brodi di arricchimento (il surnatante delle colture dopo centtifugazione) devono essere portati a temperatura ambiente (20-25 C / F) prima del loro utilizzo. Elevate temperature del brodo possono causare falsi positivi mentre si misura l assorbanza al termine della procedura di analisi. Seguire attentamente la procedura di lavaggio raccomandata. Evitare il prosciugamento dei pozzetti tra un passaggio e l altro del saggio. 1. Inserire nel supporto della micropiastra un numero sufficiente di pozzetti per tutti i controlli e i campioni da eseguire in duplicato. Registrare le rispettive posizioni. 2. Addizionare nei rispettivi pozzetti 100µl di ciascun controllo o campione preparato in duplicato 3. Aggiungere 100µl di coniugato 1 a ciascun pozzetto, miscelare delicatamente facendo oscillare manualmente la piastra ed incubare per 1 ora a temperatura ambiente (20-25 C / F). Durante l incubazione si raccomanda di coprire la micropiastra. 4. Svuotare i pozzetti del liquido in essi contenuto e rovesciare la micropiastra per tre volte su carta assorbente picchiettandola energicamente per assicurare la completa fuoriuscita del liquido dai pozzetti. Riempire questi ultimi con 300 µl di tampone di lavaggio (vedi10.1.) e svuotarli di nuovo. Ripetere per altre quattro volte. 5. Addizionare in ogni pozzetto 100 µl di coniugato 2 e incubare per 30 min. a temperatura ambiente (20-25 C / F). Durante l incubazione si raccomanda di coprire la micropiastra. 6. Svuotare i pozzetti del liquido in essi contenuto e rovesciare la micropiastra per tre volte su carta assorbente picchiettandola energicamente per assicurare la completa fuoriuscita del liquido dai pozzetti. Riempire questi ultimi con 300 µl di tampone di lavaggio (vedi 10.1.) e svuotarli di nuovo. Ripetere per altre quattro volte. 7. Addizionare in ciascun pozzetto 100 µl di substrato/cromogeno. Miscelare manualmente con cautela e incubare per 15 min. a temperatura ambiente (20-25 C / F). RIDASCREEN Verotoxin

10 8. Addizionare in ogni pozzetto 50 µl di reagente di stop. Miscelare manualmente con cautela e rilevare le assorbanze a 450/620 nm. Leggere i risultati entro 10 minuti dall aggiunta della soluzione di stop. 11. Risultati Per l interpretazione di risultati è disponibile il software RIDA SOFT Win (Art. No. Z9996) Controllo qualità per la verifica della validità dell analisi eseguita Il controllo positivo deve raggiungere un valore di assorbanza di 0.8 o superiore Il controllo negativo deve avere un valore di assorbanza inferiore a 0.16 Se tali condizioni non sono rispettate, verificare i seguenti passaggi e correggerli prima di ripetere l analisi: - verificare la data di scadenza - assicurarsi che i componenti del kit siano stati portati a temperatura ambiente per un periodo di tempo sufficiente - utilizzare un puntale nuovo per ogni campione e per ogni controllo, al fine di evitare cross-contaminazioni - verificare il tempone di lavaggio per possibili contaminazioni (utilizzare acqua sterile per la preparazione) - procedura di lavaggio raccomandata inadeguata/insufficiente (vedi 10.2) - pipette contaminate (pulirle regolarmente) 11.2 Interpretazione dei risultati Il valore di cut-off per la valutazione dei risultati come NEGATIVI oppure POSITIVI è calcolato aggiungendo 0.15 all assorbanza del controllo negativo: Valore di cut-off = assorbanza controllo negativo I campioni sono considerati POSITIVI quando il test è valido ed il valore di assorbanza è superiore o uguale al valore di cut-off. 2. I campioni sono considerati NEGATIVI quando il test è valido ed il valore di assorbanza è inferiore al valore di cut-off. 10 RIDASCREEN Verotoxin

11 12. Sensibilità analitica Per determinare la sensibilità analitica del kit RIDASCREEN Verotoxin ELISA, è stato analizzato il limite del bianco (LoB) in 90 analisi del campione negativo (brodo di arricchimento) ed il limite di rilevazione (LoD) in 72 analisi di due tossine. I risultati delle misurazioni eseguite sono mostrati nelle tabella 1. Tabella 1: Sensibilità analitica del test RIDASCREEN Verotoxin ELISA MV [OD 450/620] pg/ml LoB LoD Verotossina LoD Verotossina MW = Mittelwert OD = Optische Dichte 13. Specificità Nessuna crossreattività è stata evidenziata dall analisi mediante RIDASCREEN Verotoxin di microrganismi patogeni dell intestino e non. Le colture sono state propagate in un terreno non selettivo. Con il kit RIDASCREEN Verotoxin sono state studiate differenti specie batteriche che possono trovarsi nei campioni alimentari pre-arricchiti e non è stata riscontrata alcuna cross-reattività se non con lo S. aureus. Gli studi sono stati condotti con sospensioni batteriche con concentrazioni di 10 6 a 10 9 organismi per ml. Lo S. aureus è stato introdotto ad una concentrazione di ~ 6,3 x 10 7 CFU/ml e ha mostrato risultati positivi deboli in 2 di 3 repliche (vedi tab. 2). RIDASCREEN Verotoxin

12 Tabella 2: Specificità del kit RIDASCREEN Verotoxin Organismo Origine Valore medio [OD 450nm/620 nm] Aeromonas hydrophila Coltura Bacillus cereus Coltura Bacteroides fragilis Coltura Candida albicans Coltura Citrobacter freundii Coltura Enterobacter cloacae Coltura Enterococcus faecalis Coltura Escherichia coli Coltura Escherichia coli Coltura Escherichia coli Coltura Escherichia coli Coltura Escherichia coli Coltura Escherichia coli Coltura Escherichia coli Coltura Escherichia coli Coltura Escherichia coli Coltura Escherichia coli (O26:H-) Coltura Escherichia coli (O6) Coltura Klebsiella oxytoca Coltura Proteus vulgaris Coltura Pseudomonas aeruginosa Coltura Salmonella enteritidis Coltura Salmonella typhimurium Coltura Serratia liquefaciens Coltura Shigella dysenteriae Coltura Shigella flexneri Coltura Shigella sonnei Coltura Staphylococcus aureus Coltura Staphylococcus epidermidis Coltura Vibrio parahaemolyticus Coltura Yersinia enterocolitica Coltura RIDASCREEN Verotoxin

13 14. Precisione La precisione del kit RIDASCREEN Verotoxin è stata determinata utilizzando sei riferimenti che rappresentano l intervallo di misurazione positivo da alto a debole (1-6). Per determinare la precisione intra-assay, sono state analizzate 40 repliche di questi riferimenti. I valori medi (MV) ed i coefficienti di variazione (VC) sono stati determinati per 3 lotti. Per la precisione inter-assay, sono stati analizzati in duplicato i riferimenti in 10 giorni lavorativi diversi, con 2 corse al giorno. Le misurazioni sono state eseguite con 3 lotti diversi da 2 tecnici. La precisione inter-lot è stata determinata per i 3 lotti. I risultati sono riportati nella Tabella 3. Tabella 3: Risultati della precisione del kit RIDASCREEN Verotoxin R-Biopharm non fornisce alcuna garanzia, esplicita o implicita, oltre a quella relativa alla qualità standard dei materiali di cui sono costituiti i suoi prodotti. Nel caso tali materiali risultassero difettosi, R-Biopharm si impegna a fornire prodotti sostitutivi. Non esiste garanzia di commerciabilità o di idoneità del prodotto per uno scopo particolare. R-Biopharm non è da ritenersi responsabile per danni, ivi compresi danni speciali o indiretti, o spese derivanti direttamente o indirettamente dall utilizzo del prodotto. RIDASCREEN Verotoxin