RIDASCREEN Ochratoxin A 30/15

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1 RIDASCREEN Ochratoxin A 30/15 Test immunoenzimatico per l analisi quantitativa dell ocratossina A Art. No.: R1311 Test in vitro Conservare a 2-8 C R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany Tel.: +49 (0) / Telefax: +49 (0)

2 Prodotto da: R-Biopharm AG An der neuen Bergstraße 17 D Darmstadt Per informazioni Telefono: Centralino ( ) Telefax / Ordini ( ) orders@r-biopharm.de Marketing ( ) info@r-biopharm.de Distribuito da: R-Biopharm Italia Srl Via dell Artigianato Cerro al Lambro MI Telefono info@r-biopharm.it RIDA e RIDASCREEN sono marchi registrati della R-BIOPHARM AG Produttore: R-BIOPHARM AG, Darmstadt, Germania R-BIOPHARM AG è certificata ISO RIDASCREEN Ochratoxin A 30/

3 Introduzione RIDASCREEN Ochratoxin A 30/15 RIDASCREEN Ochratoxin A 30/15 (Cod.: R1311) è un immunodosaggio enzimatico competitivo per l analisi quantitativa dell ocratossina A nei cereali, nei mangimi, nella birra e nel siero suino. Tutti i reagenti richiesti per l analisi immunoenzimatica compresi gli standard - sono contenuti nel kit. Il kit è sufficiente per 96 determinazioni (inclusi gli standard). Per la quantificazione è richiesto uno spettrofotometro per micropiastre. Preparazione campioni: Tempo richiesto: Limite di rilevabilità: cereali e mangimi: estrazione, centrifugazione o filtrazione birra e siero suino: estrazione, centrifugazione, filtrazione, agitamento, seconda estrazione, centrifugazione ed evaporazione preparazione dei campioni (10 campioni) cereali e mangimi...ca. 0.5 h birra e siero suino...ca. 2.5 h esecuzione del test (tempo d incubazione)...45 min cereali e mangimi (9.1.) ppb cereali e mangimi (9.2.) ppb birra e siero suino:...approx. 50 ppt Recupero: cereali e mangimi... ca. 100 % birra e siero suino... ca. 100 % Specificità: La specificità di RIDASCREEN Ochratoxin A 30/15 è stata stabilita analizzando la cross-reattività verso le micotossine corrispondenti. Ocratossina A % Ocratossina C % Ocratossina B % Ocratossina α... < 0.1 % RIDASCREEN Ochratoxin A 30/

4 1. Scopo RIDASCREEN Ochratoxin A 30/15 è un immunodosaggio enzimatico competitivo per l analisi quantitativa dell ocratossina A nei cereali, nei mangimi, nella birra e nel siero suino. 2. Generale L ocratossina A è una micotossina prodotta da funghi delle specie Aspergillus e Penicillium. Oltre a una marcata nefrotossicità, l ocratossina A ha un azione epatotossica, teratogena, cancerogena e immunodepressiva. Il rischio per la salute dell uomo deriva non solo dall assunzione di alimenti vegetali contaminati, ma anche dal consumo di alimenti di origine animale. L ocratossina A è stata rilevata sia nel sangue e nel rene dei suini, sia nel sangue umano e nel latte materno. 3. Principio del test Il test si basa su una reazione antigene-anticorpo. I pozzetti della micropiastra sono sensibilizzati con anticorpi specifici per l ocratossina A. Nei pozzetti si aggiungono gli standard per l ocratossina A o le soluzioni campione e l enzima coniugato. L ocratossina A libera e quella coniugata all enzima competono per legarsi ai siti di legame dell anticorpo anti-ocratossina A (analisi immunoenzimatica competitiva). Il coniugato non legato viene quindi eliminato con un lavaggio. Nei pozzetti viene poi aggiunta e incubata la soluzione di substrato enzimatico e cromogeno. Il coniugato enzimatico legato trasforma il cromogeno incolore in un prodotto blu. L aggiunta della soluzione di stop provoca un viraggio del colore da blu a giallo. La determinazione quantitativa viene eseguita fotometricamente a 450 nm. Il valore di assorbanza è inversamente proporzionale alla concentrazione di ocratossina A nel campione. 4 RIDASCREEN Ochratoxin A 30/

5 4. Reagenti forniti Ogni kit contiene materiale sufficiente per 96 analisi (incluse le analisi degli standard). Ogni kit contiene: 1 x Micropiastra da 96 pozzetti (12 strip da 8 pozzetti ciascuna) coattati con anticorpi anti-ocratossina A 6 x Soluzioni standard di ocratossina A (1,3 ml ognuna) 0 ppt (zero standard), 50 ppt, 100 ppt, 300 ppt, 900 ppt, 1800 ppt di ocratossina A in soluzione acquosa 1 x Coniugato (0.7 ml)... tappo rosso ocratossina A coniugata con perossidasi, concentrato 1 x Substrato/cromogeno (10 ml)...tappo marrone contiene tetrametilbenzidina, colore rosso 1 x Soluzione di stop (14 ml)... tappo giallo contiene acido solforico 1N 1 x Diluente (7 ml)... tappo bianco diluente del coniugato 1 x Soluzione di lavaggio (sale) per la preparazione di 10 mm tampone fosfato a ph 7,4 contiene Tween 20 allo 0,05% 5. Materiale richiesto ma non fornito 5.1. Attrezzatura: spettrofotometro per micropiastre (450 nm) centrifuga evaporatore rotante o altro strumento per l evaporazione dei solventi agitatore trituratore (macinino) agitatore magnetico imbuto e filtro di carta pipette pasteur pipette graduate micropipette da µl e µl a volume variabile RIDASCREEN Ochratoxin A 30/

6 5.2. Reagenti: HCl (acido cloridrico) 1N diclorometano (cloruro di metilene, CH 2 Cl 2 ) tampone di bicarbonato di sodio (NaHCO 3 ) 0,13M a ph Avvertenze e precauzioni per gli utilizzatori Le soluzioni standard contengono ocratossina A: prestare particolare attenzione. Evitare il contatto del reagente con la cute (indossare i guanti). La decontaminazione della vetreria e delle soluzioni contenenti sostanze tossiche deve essere eseguita con una soluzione (10% v/v) di ipoclorito di sodio (candeggina) per una notte (regolare il ph della soluzione portandolo a 7 con l aggiunta di HCl). La soluzione di stop contiene acido solforico 1 N (R36/38, S2-26). 7. Conservazione Conservare il kit a 2-8 C (35-46 F). Non congelare alcun componente del kit. I pozzetti non utilizzati vanno riposti insieme all essiccante nella loro confezione originale, che deve essere ben richiusa e conservata a 2-8 C (35-46 F). L ocratossina A è fotosensibile: evitarne l'esposizione alla luce diretta. La soluzione substrato/cromogeno è fotosensibile: evitarne l'esposizione alla luce diretta. La garanzia di qualità decade dopo la data di scadenza del kit indicata sulla confezione. Non scambiare singoli reagenti appartenenti a kit con numero di lotto diverso. 8. Indicazioni di instabilità o deterioramento dei reagenti Qualsiasi colorazione bluastra della soluzione substrato/cromogeno, normalmente rossa, prima dell esecuzione del test Valori inferiori a 0,6 unità di assorbanza (A 450nm < 0,6) per lo standard zero 6 RIDASCREEN Ochratoxin A 30/

7 9. Preparazione dei campioni I campioni devono essere conservati in luogo fresco e al riparo dalla luce Cereali e mangimi Preparazione del campione per un esame semplice e rapido (limite di rilevazione: 2,5 ppb) Macinare un campione rappresentativo e miscelarlo accuratamente in un mixer. pesare 5 g di campione macinato e introdurlo in un adeguato contenitore con 100 ml di tampone di bicarbonato di sodio 0,13 M (vedi par. 5.2.) agitare energicamente per 15 minuti con l agitatore filtrare l estratto utilizzando un filtro di carta oppure centrifugare per 15 minuti a 3500 g e a temperatura ambiente (20-25 C/68-77 F) utilizzare 50 µl del prodotto per ogni pozzetto 9.2. Cereali e mangimi Preparazione del campione per screening più sensibili (limite di rilevazione: 1,25 ppb) Macinare un campione rappresentativo e miscelarlo accuratamente in un mixer. pesare 2 g di campione macinato e introdurlo in un vial per centrifuga con tappo a vite aggiungere 5 ml di HCl 1 N e agitare per 5 minuti aggiungere 10 ml di diclorometano e agitare energicamente per 15 minuti (preferibilmente tenendo i vial in posizione orizzontale) centrifugare per 15 minuti a 3500 g e a 15 C (59 F ) asportare completamente lo strato acquoso in superficie fino allo strato di campione ed eliminarlo filtrare tutto lo strato di diclorometano utilizzando un filtro di carta per separare la parte di campione e raccogliere il diclorometano filtrato in un nuovo vial per centrifuga con tappo a vite aggiungere un equivalente volume di tampone di bicarbonato di sodio 0,13 M (vedi par. 5.2.) e agitare energicamente per 15 minuti centrifugare per 15 minuti a 3500 g e a 15 C (59 F ) diluire 100 µl della fase acquosa superficiale con 400 µl di tampone di bicarbonato di sodio 0,13 M (vedi par. 5.2.) utilizzare 50 µl del prodotto per ogni pozzetto RIDASCREEN Ochratoxin A 30/

8 9.3. Birra e siero suino centrifugare il campione di siero mescolare il campione di birra oppure filtrarlo con filtro di carta per eliminare la CO 2 in eccesso diluire 2 ml del campione con 2,5 ml di HCl 1 N e 4 ml di diclorometano in un vial per centrifuga con tappo a vite agitare per 5 minuti centrifugare per 15 minuti a 3500 g e a 15 C (59 F ) asportare lo strato superiore acquoso ed eliminarlo filtrare tutto lo strato di diclorometano utilizzando un filtro di carta per separare la torta del campione e raccogliere il diclorometano filtrato in un nuovo vial per centrifuga con tappo a vite trasferire 2 ml dello strato limpido di diclorometano in un nuovo vial per centrifuga con tappo a vite estrarre lo strato di diclorometano con 2 ml di tampone di bicarbonato di sodio 0,13 M (vedi par. 5.2.) agitando per 5 minuti centrifugare per 5 minuti a 3500 g e a 15 C (59 F) raccogliere lo strato superiore di bicarbonato di sodio ripetere le operazioni di estrazione e di centrifugazione riunire entrambe le fasi con NaHCO 3 e diluire la soluzione con 0,75 ml di HCl 1 N e 2 ml di diclorometano miscelare bene per 10 minuti (con agitatore) centrifugare per 5 minuti a 3500 g e a 15 C (59 F) asportare lo strato superiore acquoso, utilizzare tutto lo strato di diclorometano ed evaporare completamente fino a totale essiccamento a 60 C (140 F), possibilmente con leggero flusso di azoto disciogliere il residuo in 1 ml di tampone di bicarbonato di sodio 0,13 M (vedi par. 5.2.) utilizzare 50 µl del prodotto per ogni pozzetto Nota: Su richiesta da inoltrare al proprio rivenditore di zona è possibile ricevere le procedure d analisi per: tessuto (epatico e renale) utilizzo in combinazione con RIDA Ochratoxin A column (R1303), per l analisi di caffè verde e caffè tostato, frutta secca e vino utilizzo in combinazione con OCHRAPREP (RBRP14/RBRP14B) per l analisi della paprica immunoaffinity column 8 RIDASCREEN Ochratoxin A 30/

9 10. Esecuzione del test Indicazioni preliminari Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (20-25 C /68-77 F) prima dell'uso. L ocratossina A coniugata con l enzima (flacone con tappo rosso) è fornita concentrata. Dal momento che l enzima coniugato diluito ha una stabilità limitata, è bene ricostituire solo la quantità necessaria per il test. Agitare bene l enzima coniugato prima di pipettarlo. Per diluire l enzima coniugato, aggiungerlo nella proporzione di 1:11 (1+10) al diluente del coniugato (vedi cap. 4., ad es. 200 µl di concentrato + 2 ml di diluente sono sufficienti per 4 strip della micropiastra). Come tampone di lavaggio è richiesto un tampone PBS-Tween. Si prega di utilizzare il sale di lavaggio contenuto nella busta inclusa nel kit (vedi cap. 4.), sciogliendone il contenuto in un litro di acqua distillata. Il tampone di lavaggio pronto all uso si conserva per circa 4-6 settimane a una temperatura di 4 C (39 F). In alternativa: Sciogliere il contenuto della busta in soli 100 ml di acqua distillata per ottenere un tampone di lavaggio concentrato 10 volte. Questa soluzione scade dopo circa 8-12 settimane se conservata a temperatura ambiente (20-25 C/68-77 F). Disciogliere una parte di questo concentrato in 9 parti di acqua distillata per ottenere la soluzione di lavaggio pronta all uso Procedura per l esecuzione del test Seguire attentamente la procedura di lavaggio raccomandata. Evitare l asciugamento dei pozzetti tra i vari passaggi del test. 1. Inserire un numero sufficiente di pozzetti nel supporto della micropiastra per tutti gli standard e i campioni da eseguire in duplicato. Registrare le posizioni ad essi assegnate. 2. Addizionare 50 µl di soluzione standard o di campione preparato ai pozzetti corrispondenti. 3. Introdurre 50 µl di enzima coniugato diluito in ogni pozzetto. Miscelare delicatamente facendo oscillare manualmente la piastra e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (20-25 C / F) e al buio. RIDASCREEN Ochratoxin A 30/

10 4. Svuotare il liquido dai pozzetti e rovesciare per tre volte di seguito la piastra su un foglio di carta assorbente picchiettandola in modo da eliminare tutto il liquido dai pozzetti. Riempire i pozzetti con 250 µl di acqua distillata (vedi par ) ed eliminare poi il liquido come descritto sopra. Ripetere la procedura di lavaggio due volte. 5. In ogni pozzetto pipettare 100 µl di soluzione substrato/cromogeno. Miscelare delicatamente facendo oscillare manualmente la piastra e incubare per 15 minuti (± 1 minuto) a temperatura ambiente (20-25 C / F) e al buio. 6. Addizionare in ogni pozzetto 100 µl di soluzione di arresto. Miscelare delicatamente facendo oscillare manualmente la piastra e leggere le assorbanze a 450 nm, entro 30 minuti dall aggiunta della soluzione di stop. 11. Risultati Per la valutazione delle analisi eseguite con i kit RIDASCREEN ELISA è possibile utilizzare un apposito software, denominato RIDA SOFT Win (cod. Z9999). Il profilo della curva standard è riportata nel Certificato di Assicurazione di Qualità allegato. Nota per il calcolo eseguito senza l utilizzo dell apposito software: Assorbanza dello standard (o campione) X100 = % assorbimento Assorbanza standard 0 Lo standard zero è così uguale al 100% e i valori di assorbanza sono calcolati in percentuale. Inserire i valori calcolati per gli standard in un sistema di coordinate su scala semilogaritmica contro le concentrazioni di ocratossina A espresse in ng/kg. Per ottenere la concentrazione di ocratossina A in ng/kg (ppt) oppure in µg/kg (ppb) effettivamente contenuta in un campione, moltiplicare la concentrazione letta sulla curva di calibrazione per il corrispondente fattore di diluizione. Operando secondo le procedure descritte, i fattori di diluizione sono: cereali e mangimi (9.1.)...20 cereali e mangimi (9.2.)...25 birra e siero suino RIDASCREEN Ochratoxin A 30/

11 R-Biopharm non fornisce alcuna garanzia, esplicita o implicita, oltre a quella relativa alla qualità standard dei materiali di cui sono costituiti i suoi prodotti. Nel caso tali materiali risultassero difettosi, R-Biopharm si impegna a fornire prodotti sostitutivi. Non esiste garanzia di commerciabilità o di idoneità del prodotto per uno scopo particolare. R-Biopharm non è da ritenersi responsabile per danni, ivi compresi danni speciali o indiretti, o spese derivanti direttamente o indirettamente dall utilizzo del prodotto. RIDASCREEN Ochratoxin A 30/