A cosa servono? Definiscono i confini esterni della cellula e regolano il traffico di molecole e segnali Dividono lo spazio interno della cellula in c

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1 LE MEMBRANE CELLULARI OVVERO: BUONE RECINZIONI PRODUCONO BUONI VICINI (ALMENO NELLE CELLULE)

2 A cosa servono? Definiscono i confini esterni della cellula e regolano il traffico di molecole e segnali Dividono lo spazio interno della cellula in compartimenti discreti Organizzano complesse sequenze di reazioni (trasduzione del segnale) Giocano un ruolo determinante nella conservazione dell energia e nella comunicazione cellula-cellula

3 Perché un doppio strato di fosfolipidi? - 1 Nelle micelle, le catene idrofobiche sono confinate nel nucleo della sfera. All interno non c è acqua Nel doppio strato, tutte le catene aciliche (eccetto quelle ai lati) sono protette dal contatto con l acqua

4 Perché un doppio strato di fosfolipidi? - 2 Quando un doppio strato bidimensionale si avvolge su se stesso, si forma una vescicola chiusa tridimensionale (liposoma) liposoma), che include una cavità con acqua

5 In soluzione acquosa, la maggior parte dei PL e GL si dispongono in uno strato bimolecolare (liposoma) piuttosto che di micella L assemblaggio spontaneo in questa forma è Durante il processo, vengono eliminate le molecole di acqua e forze di van der Waals tra le catene idrocarburiche favoriscono uno stretto impacchettamento. Tra le teste polari e l acqua si esercitano attrazioni elettrostatiche e si formano legami idrogeno.

6 Proprietà Resistenti, ma flessibili Autosigillanti, ma liberamente permeabili a soluti apolari, selettivamente permeabili a soluti polari (barriere idrofobiche) Contengono proteine che promuovono o catalizzano eventi molecolari Sono strutture dinamiche

7 Da quali molecole è composta principalmente? - I Componente proteica Componente lipidica (effetto barriera) Fosfolipidi Colesterolo libero Componente glicidica Detta anche glicocalice, sempre esterna alla membrana, funzioni quali la ricezione e trasduzione di segnali, riconoscimento cellula-cellula, adesione specifica Glicolipidi Glicoproteine

8 Architettura della membrane: il modello a mosaico fluido Proposto nel 1972 da Singer e Nicolson Doppio strato fosfolipidico Proteine intra e intermembrana Le proteine possono sporgere all interno o all esterno o attraversare la membrana e questo la rende asimmetrica

9 La fluidità della membrana è controllata dal contenuto di FA e colesterolo La presenza di un doppio legame in cis genera un ansa nella struttura diminuendone la compattezza Il tipo della testa polare dei fosfolipidi può influenzare la fluidità: la fosfatilcolina la fa crescere, la fosfatiletanolammina la diminuisce. Il colesterolo funziona da "tampone" contro variazioni molto grandi di fluidità. Berg et al., BIOCHIMICA 6/E, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2007

10 Movimento di un singolo fosfolipide nella membrana Le interazioni tra lipidi e gli altri componenti NON sono covalenti per cui ogni molecola è libera di spostarsi lateralmente nel piano della membrana Veloce solo se catalizzata Rapida, non richiede catalisi D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

11 Liberi di muoversi, ma non troppo! Cammino di un PL reso fluorescente seguito per 56 msec in 4 regioni (250 nm in diametro, diverso colore). Questo andamento suggerisce che i PL siano chiusi in recinti molecolari (vedi proteine di membrana) che raramente possono saltare. D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

12 Anche i fosfolipidi concorrono all asimmetria della membrana

14 Le proteine di membrana possono essere classificate in base alle condizioni necessarie per staccarle dalla membrana. Le proteine periferiche possono essere rilasciate variando ph o forza ionica, agenti denaturanti come l urea o per rimozione di ioni Ca ++ da parte di chelanti. Le proteine integrali possono essere estratte con detergenti o con specifiche fosfolipasi (per GPI).

15 Classificazione delle proteine integrali di membrana Differiscono nell orientamento Diverse eliche transmembrana ma fanno parte della stessa catena polipetidica Domini transmembrana di diverse catene polipetidiche uniti a formare un canale che attraversa la membrana Proteine ancorate con lipidi Proteine ancorate sia con lipidi che con eliche transmembrana

16 Proteine di membrana ancorate a lipidi Il legame è sempre covalente, quindi molto stabile Le proteine con ancore costituite da glicosilfosfatidilinositolo (GPI) sono sempre sulla superficie extracellulare della membrana plasmatica D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

17 A cosa servono le proteine in membrana? Stabilizzazione della membrana Trasporto e movimento di soluti Interazione cellula-cellula e adesione D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

18 Gli sfingolipidi e il colesterolo si uniscono insieme per formare agglomerati detti lipid RAFT (zattere) Si evidenziano come microdomini più densi Sono molto resistenti ai detergenti Le punte che si vedono sono le proteine con ancore costituite da glicosilfosfatidilinositoli (GPI)

19 Le caveole sono piccole invaginazioni della membrana plasmatica ( nm) con un particolare contenuto di lipidi (Anderson, 1998): glicolipidi, colesterolo e proteine (GPI). Sono inoltre presenti recettori e proteine segnale che non richiedono modificazioni con lipidi per associarsi alla membrana (PKCa). Le proteine caratterizzanti la struttura formano la famiglia delle caveoline che hanno in comune la capacità di oligomerizzare e legare il colesterolo. Acido palmitico (dominio carbossi terminale) Biol Res 35: , 2002

20 lipid raft e caveolae A)Caveola al microscopio elettronico Le caveole occupano il 30-70% della membrana plasmatica di alcune cellule quali le endoteliali, gli adipociti e i pneumociti di tipo I. B) Confronto tra la composizione di lipid rafts e delle caveole (Galbiati et al., 2001). I lipid rafts si formano dalla coalescenza di colesterolo e sfingolipidi; come risultato questi microdomini hanno diverse attività biologiche che dipendono dalla composizione del doppio strato di PL. Le caveole sono generalmente considerate lipid raft invaginati per acquisizione delle caveoline.

21 Sistemi di trasporto di membrana Ogni cellula esprime uno specifico gruppo di trasportatori sulla membrana plasmatica. I trasportatori determinano la composizione ionica intracellulare e la natura dei composti che vengono trasportati dall ambiente circostante. Possiamo dire che ogni cellula può intraprendere solo quelle reazioni i cui substrati sono trasportati dall esterno all interno della cellula stessa.

22 I soluti possono attraversare le membrane, ma spesso hanno bisogno di un aiutino D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright

23 Un soluto neutro attraversa la membrana verso la zona a bassa concentrazione fino a raggiungere l equilibrio IL movimento di un soluto carico dipende dal potenziale elettrico e dalla differenza di concentrazione

24 Nella diffusione semplice, l energia di attivazione è molto elevata perché la rimozione dell acqua è una reazione fortemente endoergonica. La presenza di una proteina trasportatrice riduce sensibilmente l energia di attivazione. Si formano interazioni non covalenti con il soluto deidratato.

25 Se le particelle possono passare attraverso il doppio strato lipidico per semplice diffusione, allora nulla può limitare il numero di esse che attraversa la membrana. Quindi il tasso di diffusione aumenta linearmente con l' aumento della concentrazione di particelle da un lato della membrana Se le particelle possono passare solo attraverso le proteine canale, allora il tasso di diffusione viene determinato sia dal numero di canali che dal numero di particelle. Una volta che i canali lavorano alla massima capacità, ogni ulteriore aumento di particelle non determina un aumento del tasso di diffusione. A questo tasso limite si dice che le proteine canale sono saturate.

26 I trasporti di membrana possono essere distinti facilitata perché: per diffusione da quelli per semplice diffusione La diffusione semplice può muovere sostanze solo secondo gradiente di concentrazione; la diffusione facilitata muove sostanze secondo e contro gradiente di concentrazione La diffusione semplice non mostra saturazione; la diffusione facilitata è limitata dal numero di proteine funzionali di membrana e può essere saturata. La diffusione semplice si riscontra solo nei procarioti mentre quella facilitata solo negli eucarioti. La diffusione semplice non richiede energia, la diffusione facilitata richiede una fonte di ATP

27 I trasportatori differiscono per numero di substrati trasportati e per la direzione del trasporto. In caso di trasporto passivo, la direzione segue il gradiente di concentrazione e si ferma al raggiungimento dell equilibrio. Nel trasporto attivo primario è richiesta energia che si ricava da una reazione esoergonica (ATP ADP+Pi). Nel trasporto secondario, il gradiente di uno ione X viene stabilito da trasporto attivo primario. Il movimento di X, in favore del suo gradiente elettrochimico, fornisce energia per il cotrasporto di un soluto S contro il suo gradiente elettrochimico D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

28 Gli ionofori: molecole idrofobiche in grado di traghettare ioni attraverso le membrane. La valinomicina, è un piccolo peptide ciclico, idrofobico capace di legare il K seguendo la direzione del gradiente di concentrazione dello ione. Il risultato del trasporto è la scomparsa del gradiente. La valinomicina viene utilizzata come antibiotico: la cellula batterica muore perché la scomparsa del gradiente porta ad una alterazione dei processi di trasporto secondario e con le reazioni di conservazione dell energia.. Le acquaporine (AQP) sono una famiglia di proteine canale che facilitano il flusso molto veloce dell acqua (10 9 /sec) all'interno o all'esterno delle cellule quali tubuli prossimali, eritrociti, membrane dei vacuoli delle cellule vegetali.

29 I tre tipi di trasporto secondario: I. Uniporto una sola sostanza che si muove sfruttando la differenza di potenziale elettrochimico creato da trasportatori primari. II. Antiporto trasporto contemporaneo di due specie ioniche o di altri soluti che si muovono in direzioni opposte attraverso la membrana. Una delle due sostanze viene lasciata fluire secondo gradiente, da un compartimento ad alta concentrazione ad uno a bassa concentrazione. Questo genera l'energia entropica necessaria per guidare il trasporto dell'altro soluto contro gradiente, da bassa ad alta concentrazione III. Simporto usa, analogamente all'antiporto, il flusso di un soluto secondo gradiente per muovere un'altra molecola contro gradiente ma il movimento avviene in questo caso attraversando la membrana nella stessa direzione.

30 Il trasporto del glucosio : la famiglia GLUT La cellula per il funzionamento ha bisogno di un costante apporto di GLC Nelle cellule l entrata del glucosio è permessa da una famiglia di proteine integrali di membrana: (GLUT) specifiche per tessuto. Formano un canale transmembrana attraverso il quale il GLC attraversa la membrana cellulare per diffusione facilitata. TRASPORTATORE TESSUTO NOTE Glut 1 Tessuti fetali. nell adulto: eritrociti e cellule endoteliali di tessuti quali la barriera ematoencefalica Glut 2 tubuli renali, epitelio del piccolo intestino, fegato e cellule del pancreas. I livelli diminuiscono quando la glicemia aumenta. Isoforma ad alta capacità e bassa affinità Glut 3 Placenta e neuroni Isoforma ad alta affinità Glut 4 tessuto adiposo e muscolo striato Regolato dall insulinemia D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

31 Modello di trasporto del glucosio negli eritrociti per mezzo del GLUT1 Può assumere due conformazioni: T1 e T2 Il GLC si lega al sito stereospecifico della forma T1 e favorisce il cambio conformazionale (diminuisce G) - cambio conformazionale che permette il passaggio transmembrana del GLC Rilascio GLC nel citosol e ripristino della conformazione T1 L overespressione di GLUT1 è associata alle complicazioni tipiche del diabete (retinopatie e nefropatie) e patologie cardiovascolari D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

32 La Na + K + ATPasi Proteina integrale di membrana composta da due subunità, è la principale responsabile del mantenimento delle concentrazioni intracellulari di Na + e K + e della generazione del potenziale elettrico transmembrana Essenziale per la trasmissione di segnali nei neuroni Il gradiente di Na viene usato nei sistemi di cotrasporto di differenti soluti in molti tipi cellulari D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

33 La Na + K + ATPasi: il meccanismo La diversa affinità per il Na + o per il K + è dovuta alla fosforilazione ad opera di ATP: nella forma P, l enzima ha un elevata affinità per il K, nella forma dep perde la sua affinità per il K e la acquisisce per il Na. In un uomo a riposo il 25% dell energia totale viene utilizzata da questa pompa!! D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

34 La Na + K + ATPasi: gli inibitori Ouabaina (dal somalo waa bayyo, freccia avvelenata) si lega all enzima quando ha intrappolato le 2 molecole di K e impedisce il trasporto. Politossina (estratta dal corallo delle Hawaii) converte il trasportatore in un canale ionico aspecifico Digitossigenina (dalle foglie della Digitalis purpurea) per il trattamento dell insufficienza cardiaca congestizia, perché inibisce l efflusso di Na

35 La Na + K + ATPasi: non solo sodio potassio Il glucosio viene cotrasportato con gli ioni sodio nelle cellule intestinali D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

36 La ATP sintasi mitocondriale è una F o F 1 ATPasi costituita da una proteina integrale sensibile alla oligomicina (F o ) e una periferica (F 1 ), in cui sono presenti 3 siti attivi ( 3 ) dove avviene la sintesi di ATP (catalisi rotazionale). L affinità della subunità per ADP o ATP dipende da modificazioni conformazionali L efficienza di questa macchina molecolare è quasi del 100%!!!!! Reversibilità delle ATPasi La F o fornisce un canale transmembrana attraverso il quale vengono pompati protoni che provocano la rotazione della F1.

37 Un ameba fagocita un protozoo Un macrofago fagocita globuli rossi Trasporto tramite vescicole Trasporto dall interno vs l esterno Trasporto dall esterno vs l interno Fagocitosi Pinocitosi Endocitosi mediata da recettore Potocitosi (caveole)

38 Fusione delle membrane Richiede che: le due cellule o gli organuli si riconoscano le loro superfici si avvicinino tanto da determinare perdita di acqua associata alle teste polari dei lipidi i loro doppi strati si rompano localmente i loro doppi strati si fondano formandone uno solo continuo il processo si inneschi nel momento opportuno e in risposta a specifici stimoli Le proteine di fusione governano questi eventi (temporanea distorsione della struttura a doppio strato) D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

39 Meccanismo di fagocitosi Le immagini mostrano in successione il processo d'incorporazione di alcuni batteri da parte del macrofago: è la cosiddetta fagocitosi.

40 Esempi di endocitosi recettore-mediata Transferrina (vescicole non rivestite)

41 La struttura della Clatrina

42 Sito di legame per la clatrina Il complesso AP2 e il trasporto recettore- mediato con vescicole rivestite Owen & Evans (1998) Science 282: 1327; Owen et al. (1999) Cell 97: 805; Owen et al. (2000) EMBO J. 19:

43 LDL receptor The low-density lipoprotein receptor (LDLR) is responsible for the uptake of cholesterol- containing lipoprotein particles into cells. The amino-terminal region of LDLR, which consists of seven tandemly repeated, approximately 40-amino-acid, acid, cysteine-rich modules (LDL-A modules), mediates binding to lipoproteins. The structure of ligand-binding repeat 5 (LR5) of the LDLR, contains a calcium ion coordinated by acidic residues that lie at the carboxy-terminal end of the domain and are conserved among LDL-A modules. Naturally occurring point mutations found in patients with the disease familial hypercholesterolaemia alter residues that directly coordinate Ca 2+ or that serve as scaffolding residues of LR5.

44 Esempi di endocitosi recettore-mediata LDL (vescicole rivestite, coated pit)

45 LDL receptor regulation