Metabolismo dei metalli. Ferro e rame

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1 Metabolismo dei metalli. Ferro e rame

2 Ruolo biologico del rame e del ferro Rame e ferro sono metalli essenziali per tutti gli organismi perché si trovano legati a proteine indispensabili alla vita della cellula (respirazione, fotosintesi, fissazione dell azoto, ciclo di Krebs, trasporto dell ossigeno, sintesi del DNA, regolazione genica ecc.) Fe citocromo ossidasi emoproteine (citocromi, emoglobina) proteine con centri Fe-S proteine a ferro non-eme Cu citocromo ossidasi superossido dismutasi ceruloplasmina lisil ossidasi tirosinasi dopammina b idrossilasi - metallotioneina Rame e ferro sono tossici se presenti in quantità eccessive e se non sono complessati a proteine perché reagiscono con O 2 generando specie reattive dell ossigeno (ROS) che sono in grado di danneggiare proteine, DNA e lipidi (membrane) Reazione di Haber-Weiss catalizzata da metalli O 2 + Fe 2+ O Fe 3+ 2 O H + O 2 + H 2 O 2 Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + OH - + OH.

3 Reazioni di ossidazione catalizzate da metalli Proteine: modificazione degli amminoacidi Amminoacido Cisteina Metionina Triptofano Fenilalanina Tirosina Istidina Arginina Lisina Prolina Treonina Glutammato/glutammina Prodotto di ossidazione Disolfuri, acido cisteico Metionina solfossido, solfone Idrossitriptofano, nitrotriptofano, kinurenina 2,3-diidrossifenilalanina, idrossifenilalanina 3,4 diidrossifenilalanina, dimeri di tirosina, dinitrotirosina 2-oxoistidina, asparagina, aspartato Glutammico semialdeide a-amminoadipico semialdeide 2-pirrolidone, idrossiprolina, glutammico semialdeide 2- ammino- 3- ketobutirrato Ossalato, piruvato

4 Reazioni di ossidazione catalizzate da metalli DNA: ossidazione delle basi Lipidi: perossidazione

5 Controllo della tossicità del rame e del ferro Sistemi di detossificazione delle specie reattive dell ossigeno (ROS) Enzimatici (superossido dismutasi, catalasi e perossidasi) Non enzimatici (vitamina E e C, glutatione, acido urico, bilirubina ecc.) Proteine di deposito Ferritina Metallotioneina I meccanismi cellulari di acquisizione del rame e del ferro sono strettamente regolati per mantenere adeguati livelli intracellulari di questi metalli

6 Il ferro In condizioni fisiologiche il ferro si trova in due stati di ossidazione: Fe 2+ d 6 S=0 oppure S=2 Fe 3+ d 5 S=1/2 oppure S=5/2 Il suo potenziale redox nelle proteine varia da -300 mv a +700 mv Il Fe 2+ è instabile in aerobiosi e viene rapidamente ossidato a ph 7 Il Fe 3+ è insolubile a ph 7 (10-18 M)

7 Strutture di siti di legame del ferro nelle proteine DAOCS Cluster Fe-S Transferrina

8 Il rame In condizioni fisiologiche il rame si trova in due stati di ossidazione: Cu + d 10 S=0 Cu 2+ d 9 S=1/2 Il suo potenziale redox nelle proteine varia da +200 mv a +750 mv

9 Strutture di siti di legame del rame nelle proteine CuA citocromo ossidasi Mononucleare Binucleare Trinucleare Metallotioneina

10 Trasporto del ferro in batteri I batteri producono siderofori, molecole a basso peso molecolare che agiscono come chelanti del Fe 3+ ad alta affinità (K a >10 30 M). I siderofori formano complessi esadentati ottaedrici con il ferro, mediante gruppi idrossammati, a-idrossi-carbossilati o catecolati. La maggior parte dei siderofori viene prodotta con un meccanismo di sintesi non ribosomiale (NRPS). I siderofori vengono internalizzati attraverso un meccanismo recettore-mediato. I siderofori fanno parte dei fattori di virulenza dei batteri patogeni.

11 Strutture di siderofori

12 Sintesi dell enterobactina in E. coli L enterobactina è prodotta da una NRPS a partire da acido 2,3-diidrossibenzoico (DHB) e serina. I geni EntE e EntB sintetizzano il DHB e lo trasferiscono sull NRPS codificata dal gene EntF dove avviene la condensazione con la serina e l assemblaggio del sideroforo.

13 Meccanismi di trasporto dei siderofori in batteri

14 Meccanismi di trasporto dei siderofori in E. coli

15 Trasporto del ferro in batteri. Modello strutturale del complesso FhuA-TonB-FhuD per l internalizzazione del ferricromo

16 Meccanismi di trasporto del ferro in batteri. Trasporto del Fe 2+ : sistema feoab Indotto in anaerobiosi Batteri patogeni: acquisizione anche mediante recettori per ferro-proteine dell ospite Recettori per transferrina e lattoferrina Recettori per l eme Questi recettori sono analoghi a quelli per il trasporto dei siderofori in quanto sono TonB-dipendenti e richiedono un sistema ABC-permeasi

17 Proteine di deposito del ferro batterioferritina e Dps

18 Regolazione del trasporto del ferro in batteri Il repressore Fur è un omodimero che si lega tra le sequenze -35 e -10 dei promotori dei geni regolati, a sequenze consenso NAT(A/T)AT NAT(A/T)AT N AT(A/T)ATN

19 Geni regolati da Fur in E. coli

20 Regolazione della biosintesi dei cluster Fe-S in E. coli

21 Trasporto del ferro in lievito Nel lievito Saccharomyces cerevisiae il trasporto del ferro all interno della cellula avviene attraverso diversi meccanismi: Trasporto reduttasi-indipendente Recettori/trasportatori di siderofori (Arn1-4) Trasporto reduttasi-dipendente Metalloreduttasi NADPH-dipendenti Fre1 e Fre2 Sistema a bassa affinità (Km 30 mm) Fet4 Sistema ad alta affinità (Km 0.15 mm) Fet3-Ftr1

22 Trasporto del ferro in lievito. Sistema a bassa affinità Fet4 è un trasportatore di metalli bivalenti Fe 2+, Cu 2+, Zn 2+, Co 2+, Ni 2+. È regolato dai livelli di ferro ed è indotto in anaerobiosi.

23 Trasporto del ferro in lievito. Sistema ad alta affinità La ferrossidasi Fet3 catalizza la reazione 4Fe 2+ + O 2 + 4H + 4Fe H 2 O La permeasi Ftr1 trasporta il Fe 3+ all interno della cellula Il sistema di trasporto Fet3-Ftr1 è conservato in diversi lieviti, quali Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans e Pichia pastoris.

24 Il complesso ferrossidasi-permeasi Fet3-Ftr1 Fet3 appartiene alla famiglia delle ossidasi blu multinucleari a rame (MCO), enzimi che legano più atomi di Cu e accoppiano l ossidazione monoelettronica del substrato alla riduzione dell ossigeno ad acqua. Ftr1 è una permeasi che presenterebbe 7 eliche transmembrana. Un motivo di sequenza REGLE nel quarto segmento TM è necessario per la funzionalità della proteina.

25 Metabolismo del ferro vacuolare e mitocondriale Il vacuolo è il sito di deposito del ferro. Ccc1 è il trasportatore del ferro dal citosol all interno del vacuolo, mentre un complesso ferrossidasi-permeasi formato dalle proteine Fet5 e Fth1 è necessario per la mobilizzazione del metallo. Nel mitocondrio avvengono alcune tappe della sintesi dell eme e la sintesi dei cluster Fe-S. Le proteine Atm1, Mrs3, Mrs4 e Yfh1 sono coinvolte nel trasporto del ferro nel mitocondrio e/o nel trasporto di cluster Fe-S dal mitocondrio al citosol.

26 Regolazione del trasporto del ferro in lievito In S. cerevisiae Aft1 e Aft2 sono fattori trascrizionali che inducono l espressione di numerosi geni in carenza di ferro. Aft1 trasloca dal citoplasma al nucleo quando il ferro è limitante e attiva la trascrizione dei geni bersaglio. Aft1 e Aft2 contengono un motivo Cys-X-Cys nel dominio di legame al DNA. In S. pombe, C. albicans, P. pastoris e altri funghi, la regolazione ferro-dipendente è mediata da repressori trascrizionali appartenenti alla famiglia dei fattori GATA a dita di zinco.

27 Fattori che regolano Aft1

28 Geni regolati da fattori di trascrizione ferro-dipendenti in lievito Fattore di trascrizione Descrizione Gene Aft1 Trasportatori FET4, FTR1, FTH1, SMF3, MRS4, CCC2, COT1 Cu chaperone Ferrossidasi Metalloreduttasi Proteine della parete cellulare Trasporto di siderofori Biosintesi cluster Fe-S Altri ATX1 FET3, FET5 FRE1, FRE2, FRE3, FRE4, FRE5, FRE6 FIT1, FIT2, FIT3 ARN1, ARN2, ARN3, ARN4 ISU1, ISU2 TIS11, HMX1, AKR1, PCL5, ICY2, PRY1 Aft2 Trasportatori SMF3, MRS4, FTR1, COT1 Cu chaperone ATX1 Ferrossidasi Metalloreduttasi Proteine della parete cellulare Biosintesi cluster Fe-S Altri FET3, FET5 FRE1 FIT1, FIT2, FIT3 ISU1 BNA2, ECM4, LAP4, TIS11 Fep1 Trasportatori fip1 + Ferrossidasi fio1 + Trasporto di siderofori str1 +, str2 +, str3 +

29 Risposta alla carenza di ferro in S. cerevisiae

30 Espressione regolata da metalli in lievito

31 Patologie associate a dismetabolismo del rame o del ferro Patologia Gene mutato Sindrome di Menkes ATP7A Carenza di rame (difettoso assorbimento del rame) Morbo di Wilson ATP7B Accumulo di rame nel fegato e nel cervello Emocromatosi di tipo I-IV HFE, TfR2, HJV, HAMP, Fpn Accumulo di ferro in diversi organi Atassia di Friedreich Frataxina Neurodegenerazione e Aceruloplasminemia Ceruloplasmina accumulo di ferro in specifiche regioni del PANK-2 cervello Sindrome di Hallevorden- Spatz Neuroferritinopatia Corea di Huntington Morbo di Alzheimer Morbo di Parkinson L-ferritina

32 Metabolismo cellulare del ferro in mammiferi

33 Proteine del metabolismo cellulare del ferro DMT1 è un co-trasportatore di cationi bivalenti e H + espresso in molti tessuti (enterociti, cellule eritroidi, rene, polmone, cervello ). Ha un ruolo nell assorbimento del ferro nel duodeno e nel meccanismo di rilascio del ferro dalla transferrina. L espressione di DMT1 è indotta da carenza di ferro e sono state identificate diverse isoforme della proteina. La Ferritina è la principale proteina di deposito intracellulare del ferro. E formata da 24 subunità di tipo H e di tipo L ed è in grado di legare fino a 4500 atomi di ferro.

34 Esporto del ferro dalle cellule: la ferroportina La Ferroportina è l unico esportatore del ferro dalle cellule finora identificato. È espressa sulla membrana basolaterale degli enterociti, nei macrofagi, negli astrociti e negli epatociti. Mutazioni della ferroportina causano accumulo di ferro nel fegato o nei macrofagi reticoloendoteliali.

35 Ferrossidasi: ceruloplasmina ed efestina Le ferrossidasi ceruloplasmina ed efestina appartengono alla famiglia delle MCO e catalizzano l ossidazione del Fe 2+ a Fe 3+ con riduzione dell O 2 ad H 2 O. La ceruloplasmina collabora con la ferroportina ossidando il Fe 2+ esportato da quest ultima e facilitandone l incorporazione nella transferrina. L efestina è una proteina di membrana intracellulare, è espressa principalmente negli enterociti ed ha un ruolo nell assorbimento intestinale del ferro.

36 L attività ferrossidasica della ceruloplasmina è necessaria per mantenere la ferroportina sulla superficie della cellula Una isoforma della ceruloplasmina è ancorata alla membrana mediante un ancora GPI ed è espressa principalmente negli astrociti. La mancanza di ceruloplasmina in queste cellule causa la scomparsa della ferroportina dalla superficie cellulare e ciò potrebbe spiegare l accumulo di ferro riscontrato in pazienti affetti da aceruloplasminemia.

37 Ciclo Transferrina-TfR

38 Il sistema regolatorio IRE/IRP. Regolazione post-trascrizionale

39 Biogenesi dei cluster Fe-S. Ruolo dei mitocondri nel metabolismo del ferro Disfunzioni nella biosintesi dei cluster Fe-S causano accumulo di ferro nei mitocondri e stress ossidativo.

40 Omeostasi sistemica del ferro Il ferro viene assorbito dagli enterociti nel duodeno, rilasciato nel sangue e trasportato ai diversi organi dalla transferrina. I macrofagi reticoloendoteliali costituiscono il sito principale di riciclaggio del ferro dagli eritrociti senescenti.

41 Regolazione del trasporto del ferro mediata dall epcidina L epcidina è un peptide di 25 amminoacidi prodotto dal fegato. Si lega alla ferroportina causandone l internalizzazione e la degradazione, in questo modo diminuisce l esporto del ferro dagli enterociti e dai macrofagi nella circolazione sanguigna. L espressione dell epcidina è indotta da eccesso di ferro e infiammazione (IL-6), e repressa da anemia e ipossia.

42 Ruolo dell epcidina nel metabolismo del ferro

43 Metabolismo del rame I meccanismi alla base dell omeostasi cellulare del rame sono conservati in batteri (in parte), in lievito e negli eucarioti superiori. Gli studi in lievito si sono rivelati particolarmente utili per identificare e/o caratterizzare proteine umane strutturalmente o funzionalmente omologhe. Il metabolismo del rame negli eucarioti è strettamente connesso con il metabolismo del ferro attraverso le ferrossidasi Cu-dipendenti: difetti nell incorporazione del rame nelle ferrossidasi provocano dismetabolismo del ferro.

44 Trasporto del rame in cellule eucariotiche. Il trasportatore di membrana Ctr1 Ctr1 è il principale trasportatore di Cu + nella cellula (Km 1-5 mm). Ctr1 possiede tre domini transmembrana e una serie di sequenze Met (MX 1-3 M) necessarie per il legame del Cu +. La complementazione funzionale in ceppi di lievito ctr1ctr3d ha permesso di isolare Ctr1 umano. L importanza di Ctr1 è dimostrata dal fatto che topi knock-out per Ctr1 muoiono allo stadio embrionale. L espressione di Ctr1 è regolata a livello trascrizionale in lievito dal fattore Mac1 e a livello post-traduzionale attraverso endocitosi e degradazione mediata dal rame (in lievito e nei mammiferi).

45 Trasporto intracellulare del rame in lievito. Chaperoni e pompe per lo smistamento del metallo Cuproproteine Cu,ZnSOD e MT citosol Citocromo ossidasi mitocondrio Fet3 membrana plasmatica Chaperoni del rame CCS citosol Cox17 mitocondrio Atx1 Golgi Pompe del rame L ATPasi Ccc2 trasporta il rame all interno del Golgi per l incorporazione in Fet3

46 Trasporto intracellulare del rame in epatociti e neuroni. Chaperoni e pompe per lo smistamento del metallo

47 Gli chaperoni del rame sono proteine di piccole dimensioni (circa amminoacidi) conservate dai batteri all uomo. Il rame viene legato come Cu + da due residui di cisteina con una coordinazione atipica. Chaperoni del rame

48 ATPasi di trasporto del rame Le pompe per il trasporto del rame appartengono alla famiglia delle ATPasi di tipo P o CPx e si trovano in batteri, lievito ed eucarioti superiori. Accoppiano il trasporto del metallo all idrolisi dell ATP con formazione di un intermedio acil-fosfato su un residuo di aspartato. Presentano 8 regioni transmembrana e una regione N-terminale di legame del rame in domini che contengono sequenze conservate MXCXXC. Nel dominio P e nel dominio N avvengono la fosforilazione dell aspartato e il legame del nucleotide. Nel dominio A avviene la defosforilazione dell aspartato. Batteri Lievito Mammiferi CopA, copb Ccc2 ATP7A, ATP7B

49 Meccanismo delle ATPasi di trasporto del rame

50 Efflusso del rame dalle cellule: Proteine di Menkes (ATP7A) e Wilson (ATP7B) ATP7A possiede sei domini di legame del rame È localizzata nel trans-golgi ed è espressa in enterociti, nell endotelio della barriera emato-encefalica e numerosi altri tessuti. ATP7B possiede sei domini di legame del rame È localizzata nel trans-golgi ed è espressa nel fegato e a bassi livelli nel rene, placenta, cervello e cuore.

51 La localizzazione subcellulare di ATP7A e ATP7B cambia in funzione della concentrazione di rame

52 Gli chaperoni e le pompe del rame. Meccanismo di trasferimento del metallo

53 Struttura di Atx1 e dei domini che legano il rame delle ATPasi di lievito (Ccc2) e umane (Menkes e Wilson). Il riconoscimento specifico è mediato da interazioni di tipo elettrostatico.

54 Complementarietà di carica tra chaperoni e pompe