ALLwell HistaSure ELISA Fast Track Kit

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1 ALLwell HistaSure ELISA Fast Track Kit Cat. N. LFD048 Test immunoenzimatico per la rivelazione quantitativa di istamina in campioni ittici Manuale d uso Leggere attentamente il manuale prima di procedere all uso del kit Via San Geminiano, San Prospero (MO)- Italy (: : *: laboratorio@generon.it : [1] User Manual ALLwell HistaSure ELISA Fast Track Kit Rev. 1 04/01/2016

2 1 Principio del test HistaSure ELISA Fast Track Kit è un test ELISA competitivo per la ricerca quantitativa o semiquantitativa di istamina in matrici ittiche: pesce fresco (ad es. tonno, acciuga, sgombro, aringa, salmone); pesce in scatola; pesce salato; farine di pesce. All interno del kit di analisi sono presenti i materiali per la determinazione dell istamina derivatizzata presente in estratti alimentari. L istamina per essere rilevata viene dapprima derivata a N-acilistamina attraverso una reazione con un apposito reagente contenuto nel kit. Il test utilizza un formato in micropiastra dove si instaura un equilibrio fra istamina libera e acilata legata con un antisiero coniugato con una perossidassi. Dopo una fase di lavaggio l aggiunta di un substrato cromogeno (TMB) produce una reazione colorimetrica. La lettura del test va eseguita con uno spettrofotometro a 450 nm. La quantità di anticorpo legato all istamina è inversamente proporzionale alla concentrazione di istamina presente nel campione. Il test per verificare la presenza dell istamina nel pesce fresco è una possibile strategia di controllo che può essere utilizzata da aziee di lavorazione nel loro programma HACCP per affrontare il pericolo della sirome sgombroide. L istamina è una molecola idrofila derivante dalla degradazione dell amminoacido L-istidina determinata dal metabolismo di batteri Gram-negativi (enzima istidina-decarbossilasi) in alimenti ricchi di proteine quali il pesce, il formaggio, la carne, il vino e la birra. La quantità di istamina che si forma dipee dalla specie batterica, dalla temperatura e dal tempo di esposizione, e può superare i 1000 ppm (mg/kg). I pesci sgombrotici contengono livelli di istamina superiori a 200 ppm, questi pesci possono essere alla base di contaminazioni accidentali. Per evitare problemi da sirome sgombroide è necessari determinare i livelli di istamina in un intervallo tra 10 a 200 ppm. Pesci di buona qualità contengono meno di 10 ppm di istamina, un livello di 30 ppm iica un deterioramento significativo, un valore di 50 ppm è considerato una prova definitiva di decomposizione. Il limite di sicurezza per l'istamina è di 50 ppm (PL Rogers, WF Staruszkiewicz, Journal of Aquatic Food Technology Product, Vol 9 (2) 2000 p.5-17). Materiale e attrezzatura richiesta ma non fornita dal kit: Micropipetta da 50 µl Puntali da 50 µl Macinino o frullatore Pipetta per dispensazioni ripetitive Puntali per dispensatore Acqua distillata Bilancia (5-50g) Imbuto e filtri di carta (alternativamente centrifuga) Timer Pennarello Carta assorbente Agitatore vibrante per micropiastre (ampiezza 2 mm; circa 600 rpm) Lettore ELISA con filtro 450 nm Micropipetta multicanale o lavapiastre [2] User Manual ALLwell HistaSure ELISA Fast Track Kit Rev. 1 04/01/2016

3 2 Componenti del Kit Conservare i reagenti tra 2 C-8 C fino alla data di scadenza. Non utilizzare i componenti oltre la data di scadenza. Non utilizzare reagenti di lotti diversi. Reagente Unità (Colore tappo) Volumi Piastra master 1 48 pozzetti 1 flacone di soluzione di lavaggio concentrata. Diluire con acqua fino a un volume finale di 1000 ml 1 (viola) 20 ml Substrato. Pronta all uso, contenente una soluzione di TMB 1 (nero) 12 ml 1 flacone di soluzione di arresto (H 2 SO 4 1 M). Pronta all uso 1 (grigio) 12 ml Controllo 0 ppm. Pronto all uso 1 (bianco) 4 ml Controllo 3 ppm. Pronto all uso 1 (giallo) 4 ml Controllo 10 ppm. Pronto all uso 1 (arancione) 4 ml Controllo 20 ppm. Pronto all uso 1 (verde) 4 ml Controllo 30 ppm. Pronto all uso 1 (viola) 4 ml Controllo 50 ppm. Pronto all uso 1 (blu) 4 ml Controllo 100 ppm. Pronto all uso 1 (grigio) 4 ml Controllo 300 ppm. Pronto all uso 1 (nero) 4 ml Buffer di Acilazione. Pronto all uso 2 (bianco) 50 ml Reagente acilante. Pronto all uso. Colore giallo 1 (marrone) 3 ml Strip per la rivelazione dell istamina 1 48 (6x8) Antisiero coniugato per l istamina. IgG coniugato con perossidasi. 1 (rosso) 5.5 ml [3] User Manual ALLwell HistaSure ELISA Fast Track Kit Rev. 1 04/01/2016

4 3 Precauzioni e avvertenze Questo kit è solo per uso professionale. Gli utenti dovrebbero avere una conoscenza approfoita di questo protocollo per un uso corretto del kit. Leggere e seguire le istruzioni per un corretto utilizzo del kit. Al fine di ridurre l'esposizione a sostanze potenzialmente nocive, iossare camici, guanti in lattice monouso e occhiali protettivi se necessario. Tutti i reattivi e campioni devono essere portati a temperatura ambiente (20-25 C) e mescolati delicatamente ma accuratamente prima dell'uso. Quao viene specificato l'uso di acqua per una diluizione o una ricostituzione usare acqua deionizzata, distillata o ultra-pura. La micropiastra contiene strip da separare secoo l uso. I pozzetti sono esclusivamente monouso, i pozzetti non utilizzati devono essere conservati a 2 C e 8 C in alluminio sigillato. Una volta che il test è stato avviato, tutte le misure devono essere completate senza interruzioni. Assicurarsi che i reagenti richiesti, i materiali e i dispositivi siano preparati e pronti al momento opportuno. I tempi di incubazione influenzano i risultati. Tutti i pozzetti dovrebbero essere trattati nello stesso ordine temporale. Per prevenire la contaminazione dei reagenti, utilizzare un nuovo puntale monouso per dispensare ogni reagente, campione, staard o controllo. Non mescolare diversi numeri di lotto di componenti del kit in un test e non utilizzare i reagenti dopo la data di scadenza iicata sul kit. Evitare il contatto con Stop Solution contenente M H 2 SO 4 0,25. Può provocare irritazione della pelle e ustioni. In caso di contatto con gli occhi o con la pelle, lavare immediatamente con acqua. Alcuni reagenti contengono sodio azide (NaN 3 ) come conservante. In caso di contatto con gli occhi o con la pelle lavare immediatamente con acqua. NaN 3 potrebbe reagire con piombo e rame formao un reattivo esplosivo. TMB ha un effetto irritante sulla pelle e sulle mucose. In caso di contatto, lavare gli occhi con un abboante volume di acqua e pulire la pelle con abboante acqua e sapone. Lavare gli oggetti contaminati prima di riutilizzarli. Per le informazioni sulle sostanze pericolose incluso nel kit consultare le schede di sicurezza (SDS). I reagenti del kit devono essere considerati rifiuti pericolosi e smaltiti secoo le normative nazionali. Quao si eliminano i reagenti, lavare con una grae quantità di acqua per evitare la formazione di azidi. 4 Preparazione dei reagenti Soluzione di lavaggio: Diluire una parte della soluzione di lavaggio concentrata fornita nel kit con 24 parti di acqua distillata o deionizzata (40 ml soluzione concentrata ml di acqua). Una volta preparata, questa soluzione rimane stabile se conservata tra +2 C e +8 C. Soluzione di estrazione: Diluire una parte della soluzione di lavaggio concentrata fornita nel kit con 19 parti di acqua distillata o deionizzata (50 ml soluzione concentrata ml di acqua). Una volta preparata, questa soluzione rimane stabile se conservata tra +2 C e +8 C. [4] User Manual ALLwell HistaSure ELISA Fast Track Kit Rev. 1 04/01/2016

5 5 Preparazione dei campioni I seguenti protocolli sono basti sul metodo ufficiale AOAC Official Method La campionatura deve essere realizzata in accordo con la regolamentazione nazionale. Protocollo per pesce fresco e pesce congelato Prelevare un campione di pesce fresco prima di congelarlo per l'analisi. Scongelare i campioni in frigorifero o in acqua fredda. Non scongelare i campioni in acqua riscaldata. Eliminare il liquido. Una volta scongelato conservare il campione refrigerato (2-8 C) prima del test. Pesce intero Utilizzare 6 pesci lavati, pesati ed eviscerati (se minori di 15 cm utilizzarne tra i 5 e i 10). In caso di pesci di grai dimensioni, da ciascuno pesce prelevare 3 sezioni trasversali di 2,5 cm di spessore: 1 sezione appena dietro le pinne pettorali, 1 sezione a metà tra le pinne pettorali e il ventre e 1 sezione nell ultima parte del ventre. Rimuovere la lisca. Frullare i tre prelievi fino ad ottenere un campione omogeneo. Filetti di pesce Utilizzare tutto il filetto, frullare fino ad ottenere un campione omogeneo. Protocollo per pesce in scatola e altri prodotti a base di pesce inscatolati. Utilizzare tutto il contenuto della scatola frullare fino ad ottenere un campione omogeneo. Protocollo per prodotti a base di pesce inscatolato sott olio, salse, salamoia o liquido. Scolare per 2 minuti (utilizzao un setaccio numero 8 o un colino da cucina) e frullare il contenuto liquido e solido della scatola e prelevare poi 10 g di campione. Seguire quii il protocollo per pesce fresco, pesce congelato e farina di pesce. Protocollo per farina di pesce Mescolare il campione fino ad ottenere una miscela omogenea. Estrazione Pesare 10 g di campione e aggiungere 240 ml di acqua distillata e omogeneizzare per 1-2 minuti in un macinino o frullatore. Se si analizza la farina di pesce mescolare solamente per 10 minuti a temperatura ambiente utilizzao un agitatore magnetico senza macinare il campione. Filtrare utilizzao un filtro di carta o alternativamente prelevare una aliquota del campione e centrifugarla per 5 minuti alla massima velocità, rimuovere per aspirazione l eventuale fase lipidica. Prelevare 50 µl dell estratto per la reazione di acilazione. [5] User Manual ALLwell HistaSure ELISA Fast Track Kit Rev. 1 04/01/2016

6 6 Esecuzione del test Prima di iniziare il test portare tutti i reagenti e i campioni a temperatura ambiente (22-25 C). Rivelazione semi quantitativa Per la rivelazione semi quantitativa scegliere tra i controlli forniti dal kit come punti di cut-off. Il kit fornisce i seguenti punti staard 3, 10, 20, 30, 50, 100 e 300 ppm. Rivelazione quantitativa Per la rivelazione quantitativa utilizzare i seguenti controlli per costruire la retta staard: 0, 3, 10, 30, 100 e 300 ppm. Utilizzare le istruzioni successive per costruire la retta staard. Reazione di acilazione Prelevare 50 μl di controllo e soluzione estratta dal campione. Depositarli nei pozzetti della piastra Master. Aggiungere 1.5 ml di buffer di acilazione in un unico passaggio. Aggiungere 50 μl di reagente di acilazione a tutti I pozzetti (il colore cambia da giallo a rosa). Incubare 5 minuti a temperatura ambiente (20-25 C) in agitazione 600 rpm (il colore deve essere rosa. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). Prelevare 50 μl per il test ELISA. Rivelazione dell istamina Prelevare 50 µl di controllo e campiona acilato Depositarlo nelle strip per la rivelazione dell istamina. Prelevare 100 µl di antisiero coniugato e depositarlo nei pozzetti. Incubare 10 minuti a temperatura ambiente (20-25 C) in agitazione a 600 rpm. Lavare con 300 μl di soluzione di lavaggio tre volte. Aver cura di rimuovere la soluzione di lavaggio capovolgeo la piastra. Incubare 10 minuti a temperatura ambiente (20-25 C) in agitazione a 600 rpm. Non esporre alla luce diretta. Aggiungere 100 μl di soluzione di arresto. Leggere l assorbanza della soluzione nei pozzetti entro dieci minuti usao un lettore di micropiastre a 450 nm. [6] User Manual ALLwell HistaSure ELISA Fast Track Kit Rev. 1 04/01/2016

7 7 Lettura e interpretazione dei risultati Rivelazione semi-quantitativa Se il valore dell assorbanza è maggiore di quello del punto di cut off, il campione è valido. Se il valore dell assorbanza è minore di quello del punto di cut off, il campione è non valido. Rivelazione quantitativa I valori di assorbanza dei 6 punti staard (0, 3, 10, 30, 100 e 300 ppm) vengono utilizzati per costruire una retta staard. Sull asse delle Y (lineare) vengono riportati i valori di assorbanza dei controlli e sulle X (log) le corrispoenti concentrazioni, utilizzare una regressione non lineare per disegnare la retta staard. La concentrazione dei campioni è calcolata attraverso l interpolazione con la retta staard. Se un campione presenta una concentrazione superiore a quella della retta staard l estratto deve essere diluito 1:10 con acqua distillata e rianalizzato. Il valore ottenuto deve essere moltiplicato per il fattore di diluizione 10. Questo kit è stato realizzato secoo i più recenti sviluppi della tecnologia e sottoposto a rigorosi controlli di qualità interni ed esterni. Qualsiasi modifica del protocollo del test o della procedura di prova, così come l'utilizzo di reagenti diversi può avere un effetto negativo sui risultati del test e sono pertanto non coperti da garanzia. Il produttore non è responsabile per i danni che si verificano durante il trasporto. Tabella con le diverse specie validate AOAC. Specie Sardine Tonno Mahi Mahi Tabella con le diverse specie validate dal produttore del kit. Tipologia Inscatolato sott olio Inscatolato, fresco, congelato Fresco/congelato Farina di pesce - Specie Sgombro Acciuga Alosa Aringa Salmone Bonito Tipologia Affumicato Fresco, congelato, sotto sale Secco, fermentato Affumicata Affumicato Lakerda [7] User Manual ALLwell HistaSure ELISA Fast Track Kit Rev. 1 04/01/2016

8 8 Esempio Tabella della reattività incrociata ( non rilevata) Sostanza Reattività incrociata (%) Istamina Metilhistinsa 0.44 Tiramina 0.69 L-Fenilalanina L-Istidina L-Tirosina Triptamina L-Triptofano Cadeverina 0.40 Percentuale di recupero, precisione intra e inter saggio Campione Intervallo ppm Recupero medio (%) Intervallo di recupero (%) Tonno congelato-fresco Tonno inscatolato , Mahi Mahi congelato , Sardine inscatolate ,8 99,7 Farina di pesce ,0 93,9 Precisione intra saggio Media (%) Intervallo (%) N=7 Tonno congelato-fresco Tonno inscatolato Mahi Mahi congelato Sardine inscatolate Farina di pesce Media ppm n Inter cv (%) Lotto lotti 4.16 LOD 0.44 ppm LOQ 1.31 ppm Comparazione di metodi [8] User Manual ALLwell HistaSure ELISA Fast Track Kit Rev. 1 04/01/2016

9 9 Esclusione di responsabilità Generon non si assume responsabilità di alcun tipo, esplicite o implicite, eccetto garantire che i materiali di cui i propri prodotti si compongono sono di qualità staard. In caso di materiale difettoso, Generon si impegna a fornire un prodotto sostitutivo. Generon non è tenuta a rispoere per qualunque danno, inclusi danni speciali o consequenziali, o spese che derivano direttamente o iirettamente dall`uso di questo prodotto. L'acquirente ha la piena responsabilità per il corretto uso del prodotto. Questo documento contiene informazioni che sono di proprietà di LDN. L acquirente può duplicare questo documento, in tutto o in parte, solo per scopi interni, a coizione che questa nota venga riportata in tutte le copie. Nella duplicazione l acquirente si impegna a compiere ogni ragionevole sforzo per impedire l'uso non autorizzato e la distribuzione delle informazioni sulla proprietà. Questo manuale è la semplice traduzione in lingua italiana del manuale in lingua straniera presente nel kit. [9] User Manual ALLwell HistaSure ELISA Fast Track Kit Rev. 1 04/01/2016