Esami: mercoledì 4 Febbraio h:10 mercoledì 25 Febbraio h:10

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1 Esami: mercoledì 4 Febbraio h:10 mercoledì 25 Febbraio h:10

2 La asimmetria del doppio strato è funzionalmente importante Esempio: distribuzione dei lipidi nel doppio strato lipidico nei globuli rossi umani fosfatidiletanolamina fosfatidilserina sfingomielina il colesterolo è supposto essere distribuito omogeneamente fosfatidilcolina glicolipidi Fosfatidilserina, carica, nello strato interno significativa differenza di carica tra le due metà del doppio strato

3 L asimmetria viene sfruttata per distinguere le cellule vive da quelle morte Apoptosi (morte programmata) fosfatidilserina (normalmente confinata nel monostrato interno) rapidamente migra in quello esterno fosfatidilserina esposta sulla superficie i macrofagi sono indotti alla fagocitosi La traslocazione della fosfatidilserina nelle cellule apoptotiche avviene via 2 meccanismi 1. Il meccanismo che normalmente trasporta questi lipidi dall esterno all interno è bloccato 2. Un meccanismo che trasferisce in modo aspecifico i fosfolipidi nelle due direzioni è attivato

4 I glicolipidi Sono presenti su tutte le membrane con il più alto livello di asimmetria Sono presenti SOLO sul monostrato esterno (non-citosolico) preferibilmente nei lipid rafts. Tendono ad auto-associarsi legami H + forze di van der Waals tra le lunghe code saturate Gli zuccheri sono esposti sulla superficie della cellula ed hanno un ruolo rilevante nell interazione della cellula con l ambiente circostante fosfatidiletanolamina fosfatidilserina sfingomielina fosfatidilcolina glicolipidi

5 glicolipidi 5% dei lipidi del monostrato esterno delle membrane cellulari sono presenti anche in alcune membrane intracellulari Il più complesso dei glicolipidi, il ganglioside, contiene degli oligosaccaridi con uno o più residui di acido sialico con una carica negativa glicolipide neutro Sono stati identificati più di 40 diversi gangliosidi Più abbondanti nella membrana delle cellule nervose (5-10% della massa totale di lipidi)

6 Riassumendo 1 le membrane biologiche consistono di un doppiostrato continuo di molecole lipidiche in cui sono immerse le proteine di membrana. Il doppio-strato si comporta come un fluido Le molecole lipidiche sono anfifiliche, le più numerose sono i fosfolipidi. Quando sono poste in acqua formano spontaneamente compartimenti chiusi e doppi strati

7 Riassumendo 2 Ci sono 3 classi principali di molecole lipidiche: fosfolipidi, colesterolo e glicolipidi La composizione dei monostrati interno ed esterno è diversa e riflette la diversa funzione delle due faccie della membrana Differenti proporzioni di lipidi sono presenti in membrane di diverso tipo come nelle varie membrane di una singola cellula eucariotica

8 Riassumendo 3 Acuni enzimi che legano le membrane richiedono la presenza di specifici gruppi sulla testa dei lipidi Acuni segnalatori estracellulari attivano le fosfolipasi che tagliano molecole selezionate di fosfolipide nella membrana plasmatica e generano frammenti che agiscono da segnali intracellulari

9 Le proteine di membrana

10 Sebbene i lipidi siano l elemento base delle membrane le proteine svolgono la maggior parte delle funzioni specifiche. Le proteine forniscono alle membrane la loro specificità e, quindi, il tipo e il numero è molto variabile Nella membrana mielinica, che ha principalmente lo scopo di isolare gli assoni, meno del 25% in massa sono proteine. Nelle membrane coinvolte nella produzione di ATP (come la membrana interna dei mitocondri) circa il 75% sono proteine Una tipica membrana plasmatica è per circa il 50% della sua massa formata da proteine. I lipidi sono piccoli rispetto alle proteine 50% in massa 50 lipidi / proteina

11 Proteine diverse sono associate in modo diverso con la membrana Completamente esposte all esterno attaccate al doppio strato con legami covalenti (specifico oligosaccaride) Le regioni idrofobiche passano attraverso la membrana e interagiscono con le code e le regioni idrofiliche sono esposte all acqua da entrambi i lati L idrofobicità è maggiore se vi è attaccato un acido grasso In contatto solo con il cytosol ed associate con il monostrato interno o via un elica anfipatica o con una o più catene lipidiche covalentemente legate (acidi grassi o gruppi prenile*) Non interagiscono direttamente con il doppio strato, ma via legami non covalenti con altre proteine di membrana

12 Prenolo (contrazione: alcool + isoprenoide) Si chiama estere il derivato della reazione di un alcool con un acido: R-COOH + R'-OH R-C=O-OR' L unità C 5 H 8 (in parentesi) è detta residuo isoprene. I prenoli sono i precursori di una varietà di composti tra cui gli steroidi, anche noti come isoprenoidi. Prenili Esteri e loro derivati. (prenil difosfati, ecc.)

13 Il modo in cui una proteina si associa con la membrana riflette la sua funzione parte del centro di reazione di un batterio fotosintetico Una proteina transmembrana ha sempre un unica orientazione nel doppio strato sintesi e inserzione asimmetriche differenti funzioni dei suoi domini citosolico e non-citosolico Nella maggior parte dei casi le proteine attraversano la membrana formando eliche legami peptidici polari acqua assente dal doppio-strato legami H interni alla catena peptidica proteine a molte eliche (vedi es 3) # max di legami H elica regolare

14 Indice di idropatia: predizione dei tratti di α-elica transmembrana Valori positivi: idrofobici Valori negativi: idrofilici A= glicoproteina un singolo tratto α transmembranico B= batteriorodopsina 7 tratti α transmembranici C = frazione di proteine di membrana predette per E. coli, S. cerevisiae, e uomo.

15 β barrels con un differente numero di β strands β-barrel (# β-strands: 8 22 ) più rigide delle α-eliche migliore cristallizzazione sono note varie strutture X abbondanti in mitocondri, cloroplasti ed in molti batteri; la maggior parte delle proteine transmembrana negli eucarioti è fatta di α elica più flessibili cambiamenti nella disposizione più facili apertura e chiusura dei canali porine pori per far passare soluti le catene laterali polari all interno, non-polari in interazione con le code del doppio-strato proteine di trasporto Fe attraverso la membrana esterna di un batterio 22 β-barrel + un dominio globulare Recettore di enzimi β-barrel usato come ancora per le proteina

16 La gran parte delle proteine transmembrana nelle cellule animali sono glicosilate Le catene oligosaccaridi sono sempre nella parte non citosolica Il citosol è in genere un ambiente riducente questo diminuisce le probabilità che ci siano ponti S-S nella regione citosolica I ponti S_S si formano nella parte non-citosolica dove stabilizzano la struttura

17 Le proteine transmembrana possono essere solubilizzate solo con detergenti (piccole molecole anfipatiche che fomano micelle in acqua) la parte idrofobica del detergente lega la parte idrofobica della proteina staccandola dai lipidi Poichè l altra parte del detergente è polare, la proteina tende ad andare in soluzione e alcune molecole di lipide possono rimanere attaccate La parte polare del detergente può essere carica o no

18 SDS è un detergente forte (solubilizza anche la proteina più idrofobica) denaturazione (spesso) ad opera del legame con il loro core idrofobico a volte si rinatura dopo rimozione del detergente Molte proteine possono essere solubilizzate con un detergente più leggero come il Triton X-100 e rimanere funzionali Pompa Na + -K + funzionale: purificata e incorporata in vescicole di fosfolipidi. Presente nella maggior parte delle cellule animali, usa l idrolisi dell ATP per pompare Na + fuori e K + dentro la cellula

19 La membrana cellulare dei globuli rossi è la più studiata di quelle eucariotiche reperibili in numero elevato relativamente pure la membrana plasmatica è la sola presente (non c è nucleo, nè altri organelli) (in altre cellule la membrana plasmatica è meno del 5%) Micrografia a scansione elettronica di globuli rossi umani Forma biconcava; assenza di nucleo e altri organelli E facile preparare globuli rossi vuoti ("ghosts ): cellule in un mezzo con una concentrazione di sale minore di quella all interno della cellula lisi l emoglobina e le altre proteine citosoliche escono Le membrane dei ghosts possone essere studiate aperte o risaldate Durante la risaldatura si possono anche preparare vescicole inverse

20 Come si determina da che parte sporgono le proteine transmembrana? Si attaccano covalentemente reagenti (radioattivi o fluorescenti) che non penetrano la membrana solubilizzazione con SDS autoradiografia o fluorescenza proteina transmembrana: etichetta sia all esterno (nelle cellule intatte o nei ghosts saldati) che all interno (nelle vescicole inverse) Esposizione di interno ed esterno ad enzimi proteolitici che non penetrano la membrana proteina transmembrana: digerita da entrambi i lati A. Colorazione con Coomassie blue B. Posizione delle principali proteine nel gel Glicoporina in rosso la grande quantità di carboidrati carichi negativamente la fa migrare lentamente come le proteine più grandi della banda 3 Ci sono circa 15 bande principali per un peso molecolare che va da a daltons. Tre proteine: spettrina, glicoproteina e banda 3 sono più del 60% (in peso) del totale delle proteine e ognuna di loro è disposta in modo differente nella membrana elettroforesi su gel di poliacrilamide con SDS delle proteine di membrana nei globuli rossi umani

21 La maggior parte delle proteine di membrana associate con i globuli rossi sono legate dalla parte del citosol Spettrina ( 25% in massa proteine membrana copie per cellula): filamento sottile ( 100 nm) Mantiene la forma biconcava delle cellule Eterodimero: 2 subunità simili, associate testa-testa per fomare un tetramero Le code di 4 o 5 tetrameri collegate da link con filamenti di actina ed altre proteine del citoscheletro Risultato finale: una rete flessibile che si estende su tutta la superficie citosolica della membrana che permette alle cellule di passare attraverso la strettoia dei capillari Individui (topi e uomini) anemici con anormalità nel gene della spettrina hanno cellule sferiche e fragili Ciascun eterodimero è formato da 2 catene polipeptidiche controavvolte attaccate non covalentemente tra loro in punti multipli Le teste fosforilate dove i dimeri si associano per formare il tetramero Le cateneα e β sono composte in prevalenza di domini ripetuti di 106 amino acidi

22 I dimeri di spettrina sono connessi da complessi formati da filamenti di actina (13 monomeri), adducina, e una molecola di tropomiosin Il citoscheletro è collegato alla membrana con un legame indiretto del tetrametro di spettrina ad alcune proteine della banda 3 via molecole di anchirina, o con quelle della banda 4.1 via glicoproteine Elettromicrografia del citoscheletro dal lato citosol La densità della rete di spettrina è appositamente diminuita per rendere visibili i dettagli: in una cellula normale è molto più densa

23 La Batteriorodopsina è uno degli elementi del trasduttore di energia solare che fornisce energia ai batteri E una proteina transmembrana ad attraversamento multiplo (7 catene). Ciascuna molecola contiene un cromoforo (retinale). Il retinale è identico al cromoforo della rodopsina (vitamina A) Il retinale è legato covalentemente ad una lisina. Cromoforo eccitato da un singolo fotone cambiamento di forma piccoli cambiamenti conformazionali nella proteina trasferimento di un H + da dentro a fuori della cellula. Trasferimento di protoni gradiente di H + attraverso la membrana produzione di ATP da parte di una seconda proteina di membrana

24 Esempio di Proteine di Membrana in complesso: Il centro di reazione fotosintetico batterico Struttura X: Il complesso consiste di quattro subunità: L, M, H, e un citocromo. Le subunità L e M formano il core del centro di reazione, ciascuna contiene 5 eliche α che attraversano il doppio strato. La localizzazione dei vari coenzimi di trasporto è mostrata in nero.

25 Le proteine, come i lipidi, non cambiano strato (flip-flop) ma ruotano intorno ad un asse perpendicolare al piano del doppio strato (diffusione rotazionale) e molte sono anche in grado di muoversi lateralmente (diffusione laterale). La prima diretta evidenza della mobilità delle proteine di membrana è venuta da un esperimento dove le cellule di topo sono state artificialmente fuse con quelle umane per ottenere cellule ibride (eterocarioni). Sono stati usati due anticorpi etichettati diversamente per distinguere le proteine umane da quelle di topo. All inizio i due tipi di proteine sono confinate nella loro metà in circa mezz ora diffondono lateralmente e si mescolano le une con le altre

26 La velocità di diffusione (laterale) si misura con 1. FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) La proteina è marcata con un gruppo fluorescente (anticorpi con ligante fluorescente o DNA ricombinante che esprime la proteina fusa con la green fluorescent protein, GFP). Il gruppo fluorescente è sbiancato (bleached) con un laser in una piccola area e si misura il tempo impiegato dalle forme unbleached a ripristinare il segnale nell area (=tempo di diffusione) 2. FLIP ( fluorescence loss in photobleaching) Un laser irradia continuamente una piccola area ammazzando progressivamente il segnale totale I valori di diffusione per proteine differenti sono molto diversi a causa dell interazione con altre proteine. La misura della velocità di diffusione per proteine libere indica che le membrane cellulari hanno una viscosità che è circa quella dell olio di oliva