STERILIZZAZIONE Un materiale è considerato sterile quando la probabilità di trovarvi un microrganismo è inferiore ad uno su un milione

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1 STERILIZZAZIONE La sterilizzazione consiste in qualsiasi processo chimico o fisico che porti all'eliminazione di ogni forma microbica vivente, sia patogena che non, comprese le spore e i funghi. Un materiale è considerato sterile quando la probabilità di trovarvi un microrganismo è inferiore ad uno su un milione. La sterilizzazione è utilizzata in campo farmaceutico nella preparazione di iniettabili, colliri e nella preparazione di materiali di medicazione. Indipendentemente dal metodo utilizzato è necessari tener presente che: Qualsiasi metodo impiegato non dà certezza di ottenere la sterilità, ma si hanno solo delle probabilità più o meno elevate; I processi di sterilizzazione possono avere effetti dannosi sui prodotti trattati, così bisogna raggiungere un compromesso per avere l effetto maggiore con il minimo danno.

2 Nelle attività farmaceutiche, un dato prodotto è considerato sterile quando la probabilità di trovare una unità non sterile in un lotto sterilizzato sia di 10-6, quando cioè una unità su un milione può non essere sterile. In altri termini c è la probabilità che sia sopravvissuto non più di un microrganismo vivente in 10 6 unità sottoposte a sterilizzazione. Questo concetto è espresso in termini di LAS (livello di assicurazione di sterilità). Il LAS di un prodotto viene stabilito con appropriati studi di convalida. Tale valore esprime la possibilità di trovare meno di un elemento difettoso su un milione di elementi trattati. Per assicurare valori di LAS superiori i prodotti dovranno subire una sterilizzazione detta terminale, cioè effettuata sul prodotto finale. Per assicurare la qualità del prodotto in termini di sterilità bisogna controllare ogni stadio del processo produttivo: Materiale di partenza con bassa carica batterica; Le procedure di sterilizzazione devono essere convalidate per assicurare efficacia e riproducibilità; Tutte le procedure di fabbricazione devono rispettare le GMP (caratteristiche dei locali, sterilità dell ambiente, attrezzature, contenitori, ambiente di stoccaggio); Anche il personale gioca un ruolo fondamentale nel condurre e controllare le varie fasi del processo.

3 PARAMETRI DI STERILIZZAZIONE Tempo di decadimento decimale (D) Indica il tempo necessario per ridurre una popolazione microbica di una unità logaritmica (es. da 10 6 a 10 5 ). Esso rappresenta il tempo, espresso in minuti, necessario per ottenere ad una data temperatura, la riduzione del 90% della popolazione microbica. Il valore di D è noto per molte specie microbiche ed è determinato sulla base di diverse condizioni, quali temperatura di trattamento, concentrazione di gas sterilizzante, ph, formulazione, superficie di contatto con il microrganismo ecc. Valore z Rappresenta l aumento di temperatura richiesto per ridurre il valore di D (tempo di decadimento decimale) di una unità logaritmica (o del 90%). Esso è dato dall espressione: Z = T T D log D dove T2 e T1 sono le temperature in C e D 1 e D 2 sono i valori di D corrispondenti a quelle temperature

4 Fattore di inattivazione o grado di sterilità Indica il grado di riduzione di una popolazione microbica. E dato dal rapporto tra la popolazione microbica iniziale e popolazione microbica finale in seguito ad un processo di sterilizzazione.. Esprime l efficacia di un trattamento di sterilizzazione nel distruggere una popolazione microbica F.. I = 10 F.I.= N microbi iniziali/ N microbi finali t D dove t è il tempo di trattamento in minuti.

5 CINETICA DI DEGRADAZIONE MICROBICA Ogni processo di sterilizzazione procede nel tempo secondo cinetiche ben precise. I processi di riduzione della popolazione microbica e di inattivazione delle spore seguono una cinetica del I ordine: N log K ( t t ) t = dove N e N t rappresentano le popolazioni microbiche al tempo 0 e al tempo t. N a: sterilizzazione in condizioni più severe b: sterilizzazione in condizioni più blande log N t =logn -KT

6 RESISTENZA MICROBICA La resistenza dei microrganismi alle sollecitazioni energetiche, in particolare quelle termiche, dipende da: Specie microbica: i microrganismi più sensibili sono i batteri non sporigeni, i virus più grandi, le muffe, i lieviti. Sono più resistenti i piccoli virus e le spore. Le spore sono sempre più resistenti delle forme vegetative. Numero di germi: più numerosa è la colonia batterica inizialmente presente, più lungo sarà il tempo necessario per distruggerla Le rette a e b rappresentano 2 colonie ugualmente resistenti ma diversamente popolate. La retta c indica una specie microbica più resistente.

7 Temperatura: il tempo necessario per distruggere una specie microbica è inversamente proporzionale alla temperatura impiegata. La durata del riscaldamento va riferita al tempo in cui la massa o il contenitore primario è stato soggetto a quella temperatura. In queste operazioni è opportuno tracciare un grafico che indichi l andamento effettivo della temperatura all interno del materiale. Ambiente in cui sono i germi: la resistenza microbica dipende fortemente dall ambiente. La presenza di acqua ed il % di umidità sono molto importanti. Le spore di tetano sono distrutte in ambiente umido in 15 a 120 C ed in 3 ore a C in ambiente secco. Sono importanti anche il ph e la presenza di terreni favorevoli.

8 STERILIZZAZIONE La sterilizzazione trova impiego nella preparazione di iniettabili, colliri, materiali di medicazione. Può essere definita come l eliminazione di qualsiasi forma di vita anche allo stato latente. Vi sono due cose da tener presente: o Qualsiasi metodo impiegato non dà certezza di ottenere la sterilità, ma si hanno solo delle probabilità più o meno elevate; o I processi di sterilizzazione possono avere effetti dannosi sui prodotti trattati, bisogna raggiungere un compromesso per avere l effetto maggiore con il minimo danno.

9 Antisettico sostanza che arresta o previene la crescita dei microrganismi attraverso l inibizione della loro attività, senza necessariamente provocarne l inattivazione; Battericida Agente che inattiva i microrganismi; Batteriostatico agente che arresta o ritarda la crescita dei microrganismi; Bioburder numero di microrganismi presenti all inizio del processo di sterilizzazione; Disinfezione termine che riguarda gli oggetti. E quel processo che riduce la probabilità di infezione attraverso l inattivazione dei microrganismi; Germicida agente che inattiva i microrganismi, ma non necessariamente le spore; Convalida atto di verifica che una procedura è capace di produrre il risultato atteso in tutte le possibili circostanze, Procedimento asettico operazioni condotte in completa assenza di microrganismi.

10 SECCO MEZZI FISICI CALORE RADIAZIONI UMIDO RAGGI UV RAGGI γ Vapore fluente Vapore sotto pressione Tindalizzazione METODI DI STERILIZZAZIONE FILTRAZIONE STERILIZZANTE ADSORBENTE SETACCIANTE MEZZI CHIMICI AGGIUNTA BATTERICIDI OSSIDO DI ETILENE FORMALDEIDE β -PROPIOLATTONE ACIDO PERACETICO

11 MEZZI FISICI METODI TERMICI Sono basati sul trasferimento di calore da un fluido (l aria o il vapore) agli oggetti da sterilizzare. Il calore denatura le proteine dei microorganismi determinandone l uccisione. L efficace dei trattamenti termici dipende dalla quantità di calore che possono trasferire ai microrganismi. Nello specifico, dipende da: Temperatura a cui si trova il fluido Calore specifico del fluido (Cp) Calore latente che può liberare in seguito a cambiamento di stato (vale solo per il vapore saturo) Sterilizzazione con calore secco la si usa per fiale, vetreria, polveri, oli, soluzioni oleose. Viene eseguita con stufe elettriche a doppia parete munite spesso di ventilatori per ottenere più rapidamente una temperatura uniforme. Il calore secco è poco efficace poiché l aria ha basso Cp, richiedendo tempi lunghi e temperature elevate. Il materiale soggetto a trattamento con calore secco dovrà necessariamente essere stabile a elevate temperature. Durante la sterilizzazione ci sarà un espansione del materiale, per cui i contenitori in vetro non devono essere chiusi ermeticamente e la quantità di materiale nei contenitori dovrà considerare l espansione.

12 l applicazione di calore secco risulta efficiente nelle seguenti condizioni: 160 C per almeno 2 ore. 170 C per almeno 1,5 ore. 180 C per almeno 45 minuti Il calore secco può essere utilizzato anche per la depirogenazione (speci per i contenitori in vetro) a 230 C per minuti o 250 C per minuti. Sterilizzazione con calore umido la si usa per fiale contenenti soluzioni acquose (già chiuse), tappi e tubi di plastica (termoindurente), filtri sterilizzanti, garze. Non è usata per polveri e soluzioni oleose. Il calore umido è più efficace rispetto al calore secco nell inattivare i microrganismi in quanto trasportando una quantità di energia molto maggiore. Infatti il vapore saturo, oltre ad avere capacità termica maggiore rispetto a quella dell aria, condensando libera una quantità di energia termica pari al suo calore latente di vaporizzazione (oltre 500 cal/gr contro 1 cal/gr per aria secca).

13 Vapore saturo: Il termine vapore saturo indica vapore acqueo saturato con acqua liquida. Tale condizione è possibile solo quando la fase liquida è in equilibrio con quella gassosa. A pressione ambientale ciò avviene solo a 100 C, tuttavia può teoricamente avvenire a qualsiasi temperatura purchè la pressione sia appropriata. Si effettua in autoclave. In questa apparecchiatura si adopera vapor acqueo che presenta il vantaggio di un'alta capacità termica unita alla facilità di penetrazione tra le fibre dei tessuti e nei corpi porosi. L'autoclave è costituita da un contenitore in acciaio, dotato di un portello che può essere chiuso ermeticamente dall'esterno. Posto nel contenitore il materiale da sterilizzare e serrato il coperchio, si fa penetrare all'interno, attraverso appositi condotti, il vapore acqueo proveniente da una caldaia e spinto nell'autoclave da una pompa. L'aria inizialmente contenuta nell'autoclave viene fatta uscire fino a che nel suo interno rimane unicamente vapore acqueo sotto pressione. La pressione che si raggiunge all'interno è circa 2 atm cui corrisponde una temperatura del vapore saturo di 121 C. Va tenuto presente che tutte le forme di batteri, muffe, lieviti muoiono dopo soli pochi minuti di esposizione a 100 C, e che le spore più resistenti (ad es. quelle del bacillo del tetano) muoiono a 115 C in 15'. Normalmente una buona sterilizzazione viene protratta per 20'. Si ha così la garanzia che tutte le forme patogene e non, di qualsiasi tipo sono morte e quindi il materiale all'interno dell'autoclave è perfettamente sterile.

14 Vapore fluente: è vapore non compresso che raggiunge i 100 C. Per riscaldamento di almeno un ora si eliminano tutte le forme vegetative, ma non tutte le spore. Da una caldaia si genera vapore che investe una camera di sterilizzazione. Tindalizzazione: esistono situazioni per le quali è importante mantenere basse le temperature di esposizione, come nel caso dei materiali degradabili da eccessive temperature. La tindalizzazione consiste nel riscaldare tramite vapore sostanze termolabili a temperature di 100 C in modo discontinuo, ad intervalli regolari (24 ore) per un ora, per più giorni consecutivi. Alla base del procedimento sta l osservazione che le forme microbiche vegetative vengono uccise a C. Lasciando riposare a 30 le spore si aprono e le forme vegetative sviluppatesi vengono uccise dal riscaldamento successivo. Questo metodo non dà garanzia di sterilità.

15 RADIAZIONI Raggi UV Hanno un elevato potere sterilizzante. Il basso potere di penetrazione <1 mm limita però il campo di applicazione. La luce germicida è prodotta da una lampada a vapori di mercurio ed emessa ad una lunghezza d onda di 254nm. Sono inoltre assorbite da vari materiali: vetro, plastica, liquidi torbidi. La possibilità di sterilizzare polveri o soluzioni è molto scarsa e quindi la loro applicazione è limitata alla sterilizzazione dell aria o le superfici in ambienti da sterilizzare. L azione germicida deriva dalla creazione di specie reattive (radicali) all interno della cellula batterica, con modificazioni delle reazioni biochimiche fondamentali causando, quindi, nei microrganismi morte o incapacità di riprodursi. L effetto germicida è in funzione dell intensità della radiazione e del tempo di esposizione (dose). Una controindicazione all utilizzo di queste radiazioni è che i raggi ultravioletti possono provare gravi danni agli occhi, per cui sono necessarie precauzioni da parte degli operatori.

16 Raggi γ Sono radiazioni ad alta energia dotate di sufficiente potere di penetrazione. Gli isotopi radioattivi utilizzati a questo scopo sono il cobalto-60 e il cesio-137. Il meccanismo di azione suppone la formazione di radicali liberi OH con formazione di H 2 O 2, modificazioni enzimatiche ed alterazioni del DNA (mutazione letale). Queste onde elettromagnetiche sono molto penetranti e sono fermate da lastre di piombo piuttosto spesse. Il loro impiego può risultare pericoloso. La loro lunghezza d onda è compresa tra 10 e 10-3 Ǻ e il dosaggio viene misurato in Megarads. Una dose di 2-2,5 Megarads è considerata adeguata per assicurare la sterilità. Questo tipo di sterilizzazione è utile per oggetti di gomma e plastica, ferri chirurgici, garze, siringhe, aghi ed in particolare materiale preconfezionato in buste di plastica saldate. L applicazione ai prodotti farmaceutici è ridotta dal fatto che molte sostanze subiscono alterazioni più o meno spinte.

17 FILTRAZIONE STERILIZZANTE Ha lo scopo di rimuovere fisicamente i microrganismi. E il metodo utilizzato per la sterilizzazione di soluzioni non stabili, che non sopportano altri tipi di sterilizzazione. Per essere efficace il filtro deve rimuovere i microrganismi dalla soluzione, permettendo il passaggio dei componenti la soluzione. Per la filtrazione sterilizzante si dovranno usare materiali particolari che permettano la rimozione di tutti i microrganismi. I filtri devono essere validati con saggi che mostrino la loro capacità di ritenzione batterica di un ceppo di riferimento (Pseudomonas diminuta). Considerando che le spore hanno mediamente un diametro di 0,5 micron mentre i batteri in fase vegetativa sono inferiori ad 1 micron, i filtri sterilizzanti dovranno avere dimensioni dei pori in grado di trattenere questo tipo di impurezze (in genere si utilizzano filtricon diametro pari 0.22µm) Sebbene la sterilizzazione di per se non è particolarmente efficiente, è comunque sempre eseguita prima del riempimento dei vari contenitori. E infatti l unico metodo che rimuove fisicamente i microrganismi riducendo la possibilità di inquinamento da pirogeni.

18 MEZZI CHIMICI Molte prodotti non sopportano le condizioni di sterilizzazione dei processi termici, non sono sterilizzabili con UV e non possono essere filtrati. Prodotti con queste caratteristiche sono i material termoplastici o i presidi medico chirurgici. In questi casi si sterilizza a freddo sfruttando l azioni di gas o vapori. La sostanza più utilizzata per questi scopi è l ossido di etilene. Viene utilizzato per i materiali che non sono sterilizzabili in autoclave (PVC, polietilene, alcune gomme, siringhe preconfezionate, ecc.). Come le radiazioni ionizzanti, può essere utilizzato per prodotti sigillati nel loro contenitore definitivo (se permeabile al gas), con il vantaggio di poter essere utilizzato negli stabilimenti farmaceutici e nei centri ospedalieri. D'altra parte, può formare miscele esplosive con l'aria e quindi viene utilizzato unitamente ad anidride carbonica o con idrocarburi cloro-fluorurati;.

19 PIROGENI Sono sostanze che inducono la febbre. I pirogeni endogeni sono interni all organismo e connessi con i meccanismi di regolazione della temperatura corporea. I pirogeni esogeni stimolano la risposta pirogenica di quelli endogeni. Sono essenzialmente lipopolisaccaridi (endotossine). Sono di origine batterica, largamente diffusi in natura e generati da fonti microbiche e non microbiche. Sono prodotti del metabolismo cellulare dei microrganismi o del disfacimento dei microrganismi morti. Dopo 1 ora dall iniezione producono un notevole rialzo termico, brividi, dolore, stato di malessere, vasocostrizione cutanea, aumento pressorio. Hanno P.M. elevato ( 60000). Sono attivi in quantità piccolissime (< 1 mg). Sono solubili in acqua. Passano attraverso i filtri sterilizzanti. Resistono a temperature molto più elevate di quelle usate nei processi di sterilizzazione. Perdono la loro specificità se riscaldati a C. Non sono inattivati dai battericidi. Non sono volatili.

20 PERICOLOSITA DEI PIROGENI La presenza di pirogeni in un iniettabile diventa un fattore molto serio quando il volume dell iniettabile è notevole per tre motivi: Iniettabili di grande volume contengono quantità corrispondentemente elevate di pirogeni; Iniettabili di grande volume vengono di solito somministrati per endovena e, di conseguenza, i pirogeni hanno più rapido effetto; I pazienti soggetti a trattamenti con liquidi perfusionali sono spesso in gravi condizioni ed un rialzo termico può essere pericoloso. DETERMINAZIONE DEI PIROGENI Metodica riportata in Farmacopea (iniezione nella vena marginale dell orecchio del coniglio); Saggio per la ricerca delle endotossine batteriche (Farmacopea) con lisato di amebociti di limulus poliphemus (L.A.L. test).

21 METODI DI DEPIROGENAZIONE Assorbimento con carbone attivo; Membrane microporose in nylon, caricate positivamente in superficie. Calore secco a temperature superiori a 220 C MA La migliore garanzia per l esclusione dei pirogeni da un preparato iniettabile è escludere ogni possibile inquinamento durante il suo allestimento.