ESPERIENZE DI LABORATORI ACCREDITATI IN ITALIA AI SENSI DEI DD.MM. DEL 14/4/1997
Esperienza del CAV nella realizzazione di analisi per l accreditamento di materiale di propagazione vivaistico Anna Rosa Babini, Marco Cardoni, Rita Bissani, Elena Tura CAV Centro Attività Vivaistiche, Via Tebano 144, 4018 Faenza (RA) Da oltre 15 anni il vivaismo si è organizzato in forma associativa nel C.A.V, consorzio nazionale nato per promuovere e realizzare la qualificazione delle produzioni vivaistiche, in particolare attraverso l attuazione della certificazione genetico sanitaria. In questo contesto, il CAV si è dotato di una struttura operativa basata, fra l altro, sulla funzionalità di un laboratorio specializzato nel campo delle analisi fitopatologiche riferite alle specie vegetali più frequentemente prodotte dai propri associati. Con l entrata in vigore della normativa che disciplina le produzioni CAC (D.M. 14/4/1997), l intera struttura operativa nonché l esperienza maturata dal CAV nell ambito dei programmi di certificazione è stata messa al servizio delle nuove esigenze del mondo vivaistico, chiamato ad affrontare la responsabilità dell autocertificazione imposta con la CAC. A seguito di specifica richiesta inoltrata nel 1997, il laboratorio del C.A.V. ha ottenuto l accreditamento da parte del Servizio Fitosanitario Regionale della Regione Emilia Romagna, con determinazione n 008750 del 07/09/98, per eseguire analisi fitopatologiche su fruttiferi e orticole, indirizzate all individuazione di virus, viroidi, fitoplasmi, batteri, funghi e insetti. Ha così attivato una specifica operatività finalizzata in primo luogo alle esigenze dei propri associati ed estesa comunque a tutti quei vivaisti, costitutori di novità vegetali e produttori che ne facessero richiesta. I protocolli di esecuzione dei controlli (dimensioni e modalità dei campionamenti, scelta dei metodi di analisi) sono stati di volta in volta concordati con i Servizi Fitosanitari Regionali competenti nel territorio di appartenenza del richiedente l analisi. Le metodiche analitiche proposte ed adottate hanno visto un lavoro preliminare di confronto e validazione di tecniche, reagenti e antisieri impiegati. L attività di diagnosi numericamente più cospicua affrontata in questi anni ha riguardato la determinazione della presenza di virus indicati nel DM 14/04/97; si è così operato impiegando soprattutto la diagnosi sierologica immunoenzimatica ELISA a partire da campioni senza sintomi prelevati in gran parte da tecnici del CAV che ispezionavano e campionavano la partite e/o le piante madri da accreditare.
Considerato che i vivaisti associati al CAV sono in prevalenza produttori di piante di fruttiferi e fragola e di piantine orticole, la maggioranza dei campioni esaminati nel laboratorio C.A.V. appartiene a queste tipologie. Per quanto riguarda i fruttiferi, le prunoidee hanno rappresentato la parte più corposa dei controlli eseguiti negli anni 1998, 1999 e 2000 (Tab. 1). Sono stati controllati con il test ELISA 23.528 campioni, saggiandoli per la presenza di PNRSV, PDV, PPV; di essi 20.509 sono risultati negativi, corrispondenti ad altrettante piante madri accreditabili (qualità CE ) ai sensi del D.M. 14/04/97. Il laboratorio ha operato anche nella determinazione di patogeni diversi dai virus, come ad esempio fitoplasmi e viroidi, applicando tecniche innovative e più complesse del test ELISA, che, pur consentendo l esame di un numero di campioni più ridotto, sono però indispensabili per la determinazione di questi agenti di malattie infettive. Un numero rilevante di analisi è stato eseguito anche per la determinazione della presenza di batteri patogeni di fruttiferi, in particolare fragola (Tab. 2), applicando tecniche diverse, sia basate sull isolamento diretto, sia basate sulla determinazione sierologica dei batteri patogeni, come IFAS ed ELISA. Per le specie orticole si è proceduto a controlli delle produzioni vivastiche nell unico livello di qualificazione previsto per questa tipologia di piante, cioè quello della qualità CE, considerando soprattutto, ma non solo, le piantine di pomodoro (Tab. 4). Già da diversi anni prima dell entrata in vigore del DM 14/04/97, il CAV applicava un sistema di certificazione per le produzioni del proprio gruppo associato COVI ( gruppo che riunisce 24 tra i migliori vivaisti orticoli italiani, localizzati in otto regioni sia meridionali che settentrionali), secondo un protocollo di produzione e di controlli dei lotti di piantine abbastanza simile a quanto previsto dalla direttiva che ha introdotto la categoria delle piante CAC. In questi ultimi anni il C.A.V., in accordo con il COVI, ha adottato il protocollo di produzione, controllo e analisi delle piantine orticole messo a punto e proposto dal SFR della Puglia che comunque coincideva largamente con quanto già in precedenza attuato. Nel triennio 1998 2000 sono stati sottoposti ad analisi mediante test ELISA, per un numero di virus variabile da due (per asparago) a sette (per pomodoro, e cioè AMV, CMV, ToMV, PVY, PVX, TSWV, TYLCV), 9.694 campioni per un totale di 1.048 partite di piantine (Tab. 5). Al termine dei controlli sono state accreditate 1.023 partite corrispondenti ad oltre 90 milioni di piantine conformi a quanto previsto dalla normativa vigente, coltivate in 17 aziende vivaistiche situate in prevalenza nel centro-sud Italia. Le analisi batteriologiche su specie orticole (Tab. 6)
hanno riguardato soprattutto i lotti di seme impiegati dai vivaisti, in quanto il loro stato sanitario è da considerare uno dei punti critici più rilevanti per ottenere produzioni di qualità. Il supporto offerto dal laboratorio di diagnosi fitopatologiche del C.A.V. ha permesso ai vivaisti di poter accedere ad un servizio indispensabile per la realizzazione delle loro produzioni secondo le regole stabilite dalle normative vigenti; inoltre, ha consentito loro di ottenere le prestazioni analitiche secondo criteri tecnici ed economici da loro stessi concordati e accettati, con indubbio vantaggio dell intera filiera di produzione ortofrutticola.
Tabella 1. Campioni C.A.C. analizzati FRUTTIFERI VIRUS FITOPLASMI VIROIDI BATTERI N. TOT. POSITIVI % N. TOT. POSITIVI % N. TOT. POSITIVI % N. TOT. POSITIVI % 1998 7495 663 9 64 6 9,3 10 0 0 1999 9450 1498 16 53 19 34,5 12 0 0 5 0 0 2000 6545 749 11,4 64 9 14 39 17 43,5 40 9 22,5 VIRUS Pomacee: ApMV, ACLSV, ASGV Drupacee: ApMV, ACLSV, PNRSV, PDV, PPV, SLRV, CLRV, CRLV, RRV, ToRSV, ToBRV, ArMV Tecnica: ELISA, indexaggio FITOPLASMI BATTERI Tecnica PCR: PD, AP, ESFY Pseudomonas syringae pv. syringae Xanthomonas arboricola pv. pruni VIROIDI Erwinia amylovora Tecnica ibradazione molecolare - PCR: PLMVd Tecnica: isolamento, IFAS
Tabella 2. Campioni C.A.C.. analizzati FRAGOLA VIRUS BATTERI FUNGHI N. TOT. POSITIVI % N. TOT. POSITIVI % N. TOT. POSITIVI % 1998 93 8 8,6 13 7 53,8 104 24 23,1 1999 129 5 3,8 99 88 88,9 106 25 23,6 2000 267 37 13,9 154 86 55,8 217 65 29,9 VIRUS: Tecnica ELISA: ArMV, RRV, SLRV, ToBRV, ToRSV, SMYEPV, TNV Tecnica innesto fogliare: SMYED, SCV, SMoV, SVBV BATTERI FUNGHI Xanthomonas fragariae Colletotrichum acutatum Tecnica: esame visivo, IFAS, ELISA Tecnica: isolamento, ELISA, PCR
Tabella 3. Campioni analizzati VITE VIRUS FITOPLASMI N. TOT. POSITIVI % N. TOT. POSITIVI % 1999 351 126 35,8 33 12 36,4 2000 3653 3032 83 87 43 49,4 VIRUS Tecnica ELISA: GFLV, GFKV, GLRa - 1, GLRa - 3, GLRa - 7, GVA, GVB FITOPLASMI Tecnica nested - PCR: FD e BN
Tabella 4. Campioni C.A.C. analizzati ORTICOLE VIRUS BATTERI FUNGHI N. TOT. POSITIVI % N. TOT. POSITIVI % N. TOT. POSITIVI % 1998 2492 19 0,8 161 55 34,2 13 1 7,7 1999 3186 6 0,2 80 25 31,2 13 1 7,7 2000 4432 35 0,8 88 25 28,5 48 32 66,7 VIRUS BATTERI Pomodoro: AMV, CMV, TMV, ToMV, TSWV, PVY, TYLCV, PVX Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Peperone: PMMV, ToMV, TSWV, CMV, PVY, AMV Pseudomonas syringae pv. tomato Melanzana: ToMV, TSWV, CMV, PVY Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Lattuga e indivia: LeMV, BWMV, TSWV Xanthomonas campestris pv. campestris Cavolfiore: CMV, CaMV, TSWV, TuMV, PVX, PVY Tecnica: IFAS, isolamento Sedano: TSWV, CMV Melone e zucchina: CMV, SqMV, TSWV, ZYMV, WMV-2 FUNGHI Asparago: CMV, AV2 Tecnica: ELISA Asparago: Fusarium spp. Tecnica: Isolamento
Tabella 5. Controllo C.A.C. orticole per soci c.o.v.i. 1998-2000 VIRUS CONTROLLATI CAMPIONI ANALIZZATI CAMPIONI POSITIVI PARTITE CONTROLLATE PARTITE ACCREDITATE PIANTE ACCREDITATE pomodoro 7 8.365 20 705 695 90.609.778 peperone 6 492 155 155 4.280.891 melanzana 4 21 5 5 167.044 zucchina 5 9 4 4 35.280 asparago 2 10 1 1 80.000 melone 5 88 15 15 420.138 cavolo 6 467 102 102 5.781.784 lattuga 2 99 31 31 851.678 cicoria 3 3 1 1 48.950 endivia 3 78 17 17 705.550 sedano 2 25 11 11 324.470 finocchio 2 37 1 1 308.000 TOTALE 9.694 20 1.048 1.023 103.613.563
Tabella 6. Analisi batteriologiche seme orticole 1994-2000 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 TOTALE positivi % pos. pomodoro 17 38 26 35 47 34 31 228 97 43% peperone 17 10 14 26 42 2-111 42 38% cavolo 22 25 40 63 66 24 34 274 42 15% TOTALE 56 73 80 124 155 60 65 613 181 30%