RIDASCREEN Histamin (enzymatic) Test enzimatico per il dosaggio quantitativo di Istamina Art. No.: R1605 Test in vitro Conservare a 2-8 C R-Biopharm AG, Darmstadt, Germania Tel.: +49 (0) 61 51 81 02-0 / Telefax: +49 (0) 61 51 81 02-20
Prodotto da: R-Biopharm AG An der Neuen Bergstraße 17 D-64297 Darmstadt www.r-biopharm.de Per informazioni: Telefono: Centralino (0 61 51) 81 02-0 Telefax / E-Mail: Ordini (0 61 51) 81 02-20 orders@r-biopharm.de Marketing (0 61 51) 81 02-40 info@r-biopharm.de Distribuito da: R-Biopharm Italia Srl Via Morandi, 10 20077 Melegnano MI Telefono 02 9823 3330 info@r-biopharm.it - www.r-biopharm.com RIDA e RIDASCREEN sono marchi registrati della R-BIOPHARM AG Produttore: R-BIOPHARM AG, Darmstadt, Germania R-BIOPHARM AG è certificata ISO 9001 2 RIDASCREEN Histamin (enzymatic) 14-05-06
RIDASCREEN Histamin (enzymatic) Introduzione RIDASCREEN Histamin (enzymatic) (Art. No.: R1605) è un test enzimatico in formato di micropiastra per la determinazione quantitativa di istamina in pesce fresco, conserve di pesce e sfarinati di pesce. Tutti i reagenti richiesti per il test enzimatico compresi gli standard sono contenuti nel kit. Il kit è sufficiente per 96 (comprese le analisi degli standard). Per la quantificazione è richiesto uno spettrofotometro per micropiastre. Preparazione campioni: omogenizzazione ed estrazione Tempo richiesto: Standard: preparazione dei campioni (10 campioni)... ca 25 min. esecuzione del test (tempo di incubazione)... 15 min. istamina Limite rilevabilità: pesce fresco, conserve di pesce... 0.75 mg/kg sfarinati di pesce... 3.75 mg/kg Limite quantificazione: pesce fresco, conserve di pesce... 2 mg/kg sfarinati di pesce... 10 mg/kg Recupero: ca. 85-105% Specificità: l enzima è specifico per l istamina. Non ci sono cross-reazioni con L-istidina, L-triptofano, serotonina, L-tirosina, tiramina, L-lisina, cadaverina, trimetilammina. RIDASCREEN Histamin (enzymatic) 14-05-06 3
1. Scopo RIDASCREEN Histamin (enzymatic) è un test enzimatico per l'analisi quantitativa di istamina in campioni pesce fresco, conserve e sfarinati di pesce. 2. Generale L istamina è un prodotto della decomposizione dell istidina causata dalla crescita di determinati batteri in alimenti ricchi di proteine quali il pesce, il formaggio e la carne, e nello spumante, nel vino e nella birra. La quantità di istamina che si forma dipende dalla specie batterica, dalla temperatura e dal tempo di esposizione, e può superare i 1000 ppm (mg/kg). Alti livelli di istamina riscontrati nei pesci sono stati associati con un tipo di avvelenamento chiamato avvelenamento da sgombroide. La concentrazione di istamina in alimenti refrigerati aumenta, è quindi importante effettuare l'analisi direttamente dopo il prelievo. I prodotti ittici di buona qualità contengono meno di 10 mg/kg di istamina. Il valore limite per il pesce e i suoi derivati è compreso tra 50 e 200 mg / kg a seconda della specie di pese e dal paese. 3. Principio del test La base del test è una reazione enzimatica. L Istamina-deidrogenasi (HDH-E) catalizza l'ossidazione di istamina a imidacetaldeide in presenza di un vettore di elettroni e un colorante. Il colore ottenuto è misurato a 450 nm ed è proporzionale alla concentrazione di istamina. 4. Reagenti forniti Ogni kit contiene materiale sufficiente per 96 determinazioni (compresi gli standard). Tutti i reagenti sono pronti all uso. Ogni kit contiene: 1 x Micropiastra da 96 pozzetti (12 strip da 8 pozzetti rimovibili ciascuna) rivestiti con un reagente (trasportatore di elettroni) ed un colorante 1 x tampone, 15 ml.tappo incolore 6 x standard di istamina, 1.2 ml ciascuno 0 mg/l, 1 mg/l, 5 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l di istamina in soluzione acquosa...tappo bianco 1 x soluzione enzimatica (HDH-E), 1 ml tappo rosso 1 x soluzione di spike di istamina, 1 ml, concentrazione 10 mg/ml...tappo blu 4 RIDASCREEN Histamin (enzymatic) 14-05-06
5. Materiale richiesto ma non fornito 5.1. Attrezzatura: Provette da 50 ml in PP con tappo a vite (es. Greiner; Product No. 227261) Utilizzare solo provette in plastica per la preparazione del campione. Omogennizzatore: macinino/trituratore da laboratorio, Ultra-Turrax or mixer shaker, vortex centrifuga e provette per centrifuga (in alternativa: filtrare con filtri per siringa, es. Sartorius Minisart High Flow, Product No. 16532) bagno d acqua (100 C / 212 F) micropipette a volume variabile da 100-200 µl pipette multicanale con volume di pipettaggio da 10 µl (es. Eppendorf combitipps 0.1 ml; Product No. 0030069.200) e da 150 µl (es. Eppendorf combitipps 2.5 ml; Product No. 022266306) lettore per muicropiastre (450 nm) RIDA SOFT Win.net (Z9996); utilizzare la versione 1.88 o quelle successive per il calcolo dei risultati 5.2. Reagenti: acqua distillata o deionizzata 6. Avvertenze e precauzioni per gli utilizzatori Questo test dovrebbe essere eseguito da personale di laboratorio qualificato. Le istruzioni per l uso devono essere seguite scrupolosamente. 7. Conservazione Conservare il kit a 2-8 C (35-46 F). Non congelare alcun reagente del kit. I pozzetti non utilizzati vanno riposti insieme all essiccante nella loro confezione originale, che deve essere ben richiusa e conservata a 2-8 C (35-46 F). La garanzia di qualità decade dopo la data di scadenza indicata sulla confezione. Non scambiare singoli reagenti appartenenti a kit con numeri di lotto differenti. RIDASCREEN Histamin (enzymatic) 14-05-06 5
8. Indicazioni di instabilità o di deterioramento dei reagenti Se la differenza tra l'assorbimento di A 2 - A 1 dello standard 6 è fortemente divergente dal certificato di analisi, può essere dovuto ad un deterioramento dei reagenti. 9. Preparazione dei campioni 9.1 Indicazioni preliminari Attrezzature di laboratorio sporche possono portare contaminazioni dei campioni e dei reagenti con istamina. 9.2. Pesce fresco e conservato pesare 5 g di campione omogenizzato in una provetta con tappo a vite in PP da 50 ml (utilizzare solo provette in plastica per la preparazione dei campioni) versare 20 ml di acqua distillata sul campione chiudere la provetta e mescolare tramite shaker o vortex fino a quando il campione è completamente sospeso incubare il campione per 20 minuti in un bagno di acqua bollente e mescolare di tanto in tanto lasciare raffreddare il campione centrifugare per 10 min ad almeno 2500 g (se possibile a 4 C (39 F)) in alternativa trasferire 2 ml di estratto in una provetta per centrifuga e centrifugare ad alta velocità (> 10000g) per 2 minuti in una micro-centrifuga. Se l estratto è torbido, filtrare utilizzando filtro da siringa (se si forma uno strato di grasso sulla superficie dell estratto dopo la centrifugazione, passare delicatamente attraverso lo strato di grasso e trasferire il campione in una nuova provetta e centrifugare di nuovo) utilizzare nel saggio 100 µl di estratto limpido non diluito. 8.4. Farina di pesce pesare 1 g di campione omogenizzato di farina di pesce in una provetta con tappo a vite in PP da 50 ml versare 25 ml di acqua distillata sul campione chiudere la provetta e mescolare tramite shaker o vortex fino a quando il campione è completamente sospeso lasciare raffreddare il campione 6 RIDASCREEN Histamin (enzymatic) 14-05-06
centrifugare per 10 min ad almeno 2500 g (se possibile a 4 C (39 F)) in alternativa trasferire 2 ml di estratto in una provetta per centrifuga e centrifugare ad alta velocità (> 10000g) per 2 minuti in una micro-centrifuga. Se l estratto è torbido, filtrare utilizzando filtro da siringa (se si forma uno strato di grasso sulla superficie dell estratto dopo la centrifugazione, passare delicatamente attraverso lo strato di grasso e trasferire il campione in una nuova provetta e centrifugare di nuovo) utilizzare nel saggio 100 µl di estratto limpido non diluito I campioni estratti possono essere conservati a 2.8 C (35-46 F) per 3 giorni. Gli estratti possono inoltre essere conservati a 20 C (-4 F) per 3 mesi. 10. Esecuzione del test 10.1. Indicazioni preliminari Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (20-25 C / 68-77 F) prima dell'uso. 10.2 Esecuzione del test Inserire nel supporto della micropiastra un numero sufficiente di pozzetti per tutti gli standard ed i campioni da eseguire in duplicato. Registrare le rispettive posizioni degli standard e dei campioni. 1. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere ai rispettivi pozzetti 150 µl di tampone e miscelare manualmente la piastra. 2. In ogni pozzetto aggiungere 100 µl di standard, di controlli o di campione in doppio. Eliminare i puntali dalla pipetta. Miscelare manualmente la piastra 3. Dopo 3 minuti, misurare l assorbanza A1 a 450 nm 4. Aggiungere 10 µl della soluzione di enzima con il colorante blu mediante una pipetta multicanale in ogni pozzetto. Miscelare manualmente la piastra 5. Dopo 10 minuti, misurare l assorbanza A2 a 450 nm. Per l interpretazione dei risultati utilizzare il software RIDA SOFT Win.net, selezionare A1 e A2 e calcolare. RIDASCREEN Histamin (enzymatic) 14-05-06 7
11. Risultati Per la valutazione dei test RIDASCREEN è disponibile un apposito software, denominato RIDA SOFT Win.net (Art. No. Z996, versione 1.88). Il calcolo deve essere eseguito utilizzando una regressione lineare, tenendo in considerazione il fattore di diluizione dei campioni. L andamento della curva standard è mostrato nel Certificato di Assicurazione di Qualità incluso nel kit. Campione Peso e aggiunta di acqua Fattore di diluizione Intervallo di misurazione Pesce fresco 5 g + 20 ml 5 2-100 mg/kg Farina di pesce 1 g in 25 ml 25 10-500 mg/kg Rispetto al certificato, valori di assorbanza (A 450nm ) più elevati per la curva di calibrazione, soprattutto per lo standard zero, possono significare una contaminazione da istamina. Per valori di assorbanza (A 450nm ) > standard 6, si raccomanda un ulteriore diluizione con acqua ed una nuova determinazione Raccomandazione: Risultati analitici ottimali si ottengono osservando quanto segue: - analizzare ogni campione in duplicato - testare in parallelo campioni privi di istamina e campioni contaminati (spike) con controlli Per verificare la corretta esecuzione del test e l assenza di interferenze, utilizzare per l arricchimento la soluzione di spike contenuta nel kit. 8 RIDASCREEN Histamin (enzymatic) 14-05-06
Soluzione di spike da 10 mg/kg come controllo - diluizione 1:1000 della Spike Solution Histamin (10 mg/ml) in due step es 100 µl + 3.9 ml di acqua (1:40) 200 µl di questa soluzione + 4.8 ml di acqua (1:1000 in totale) - utilizzare 100 µl nel saggio Campioni di pesce arricchiti con 50 mg/kg di istamina - aggiungere 25 µl della Spike Solution Histamin (10 mg/ml) a 5 g di pesce omogenizzato - estrarre il campione con 20 ml di acqua (vedi par. 9.2) Campioni di farina di pesce arricchiti con 250 mg/kg di istamina Nota - aggiungere 25 µl della Spike Solution Histamin (10 mg/ml) a 1 g di farina di pesce omogenizzata - estrarre il campione con 25 ml di acqua (vedi par. 9.3) R-Biopharm AG non raccomanda un estrazione del campione con acqua fredda poiché potrebbe causare una riduzione dei valori di recupero. Ulteriori informazioni sono contenute nel rapporto di validazione, disponibile su richiesta da R-Biopharm. R-Biopharm non fornisce alcuna garanzia, esplicita o implicita, oltre a quella relativa alla qualità standard dei materiali di cui sono costituiti i suoi prodotti. Nel caso tali materiali risultassero difettosi, R-Biopharm s impegna a fornire prodotti sostitutivi. Non esiste garanzia di commerciabilità o di idoneità del prodotto per uno scopo particolare. R-Biopharm non è da ritenersi responsabile per danni, ivi compresi danni speciali o indiretti, o spese derivanti direttamente o indirettamente dall utilizzo del prodotto. RIDASCREEN Histamin (enzymatic) 14-05-06 9