Determinazione della carica microbica MISURAZIONE DIRETTA CONTA TOTALE AL MICROSCOPIO (con camere di conta) CONTA VITALE (piastramento di diluizioni seriali) MISURAZIONE INDIRETTA - Misura della torbidità (spettrofotometro) - Misura della conducibilità (conduttimetro) - Misura della variazione di ph (per es. per un batterio lattico che cresce con metabolismo fermentativo producendo acido lattico) 1 DETERMINAZIONE DIRETTA DELLA CARICA MICROBICA TOTALE Conta diretta con microscopio delle cellule contenute in un volume noto di campione, attraverso l impiego di CAMERE DI CONTA (camera di Thoma o di Burker o Neubauer) In queste camere il vetrino portaoggetto è inciso in superficie con un reticolo quadrettato di cui è nota l area di ogni riquadro Dato che lo spessore tra il reticolo ed il vetrino coprioggetto è noto, è possibile determinare il volume di sospensione batterica contenuta in ogni riquadro 2
La sospensione cellulare è aggiunta qui. Lo spazio tra il vetrino portaoggetto ed il coprioggetto è noto Osservazione microscopica e conta delle cellule Calcolo del nr di cellule per ml LIMITI: - impossibile distinguere le cellule morte dalle vive; - difficoltà di conta di cellule mobili o molto piccole, come molti batteri; - inadeguato per campioni a densità cellulare bassa (circa <10 6 ) (a meno di concentrare il campione ) 3 Campione da analizzare Determinazione della carica microbica VITALE 1 ml soluzione fisiologica o una soluzione tampone adatta a preservare la sopravvivenza dei microrganismi DILUIZIONI SERIALI DECIMALI 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml Diluizione 1:10 1:100 1:1000 1:10000 1:100000 1:1000000 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Semina per spatolamento (0,1 ml) Semina per inglobamento o inclusione (1 ml) https://www.youtube.com/watch?v=tev7rlbkpqu NON CONTABILI 159 colonie 17 colonie 159 x 10 3 = 1,6 x 10 5 ufc / ml Fattore di diluizione Unità Formanti Colonia 2 0 colonie colonie *, le colonie sono visibili ESCLUSIVAMENTE DOPO INCUBAZIONE delle piastre all adeguata temperatura 4 *
Capsule Petri di terreno colturale agarizzato dopo semina delle diluizioni seriali e incubazione 5 Determinazione della carica microbica VITALE attraverso il piastramento di diluizioni seriali Permette di ottenere i migliori risultati possibili circa il numero di cellule vitali in un campione ed è perciò ampiamente utilizzata Permette di contare solo le cellule vive, dove per viva si intende una cellula capace di dividersi e di dare origine a una progenie È adatta ad individuare anche un numero molto ridotto di cellule in un campione Con l uso di opportune condizioni o opportuni terreni selettivi è possibile ottenere la conta vitale di specifici gruppi microbici Talvolta non è facile trovare condizioni di crescita (terreno, temperatura, tempo di incubazione) adatti a tutti i microrganismi di un campione microbiologicamente complesso. Inoltre, certi microrganismi crescono più rapidamente di altri Questa tecnica si basa sul PRESUPPOSTO che ogni colonia sia originata da una singola cellula vitale. Sorgono pertanto problemi per cellule legate fra loro, ad esempio in catenelle come gli streptococchi. Per questo, il risultato di questo analisi di conta microbica non è indicato come numero di cellule, ma come UNITÀ FORMANTI COLONIA (UFC) per unità di peso o di volume 6
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N.B.: al fine di stabilire nel modo più corretto possibile la carica microbica vitale di un campione, non si considerano solo le colonie di una singola piastra ad una singola diluizione, ma si considerano congiuntamente tutte le piastre aventi un numero di colonie accettabile (cioè compreso tra circa 10/20 a circa 200/300). Ciò deve essere ad esempio fatto nelle analisi di conta microbica vitale per i controlli sanitari (o per una qualsiasi analisi che abbia valore legale). Vediamo, ad esempio, cosa vi è scritto nel documento ISTISAN 08/36 dell Istituto Superiore di Sanità («Metodi microbiologici tradizionali e metodi molecolari per l analisi degli integratori alimentari a base di o con probiotici per uso umano»). : 9 Esempio: Diluizione - 6 197 colonie -6,,10 6-7 19 colonie,10 8 / 10
Conta vitale per diluzioni seriali e semina in pastra RICAPITOLANDO: - permette di contare solo le cellule vive, dove per viva si intende una cellula capace di dividersi e di dare origine a progenie. Il PRESUPPOSTO è che OGNI colonia sia originata da una singola cellula vitale. Problema per cellule legate fra loro in catenelle (vedi streptococchi). Per questo non si parla di cellule per unità di peso o di volume, ma di UNITA FORMANTI COLONIA!!! Non è talvolta facile trovare condizioni di crescita (terreno, temperatura, tempo di incubazione) adatti a tutti i microrganismi di un campione microbiologicamente complesso. Inoltre certi microrganismi crescono più rapidamente di altri. Per ovviare a questi problemi e anche ad altri, è importante preparare diverse repliche! Questa metodica permette di ottenere i migliori risultati possibili circa il numero di cellule vitali in un campione ed è perciò ampiamente utilizzata!!! È adatta a trovare anche un numero molto piccolo di cellule!!! Con l uso di opportune condizioni o terreni selettivi è possibile ottenere la conta vitale di specifici gruppi microbici. 11 Il metabolismo cellulare 12
Il metabolismo cellulare CATABOLISMO Processo esoergonico (per produrre energia) Nutriliti NAD FAD NADP e - +H + ANABOLISMO Processo endoergonico Biopolimeri (x es. proteine) ossidazione (sottrazione di e - come H) CALORE ATP energia ADP Intermedi di sintesi Intermedi di biosintesi (x es. aminoacidi) Pool di precursori intracellulari riduzione (trasferimento di e - come H) Prodotti finali Nutrienti dall esterno (CO 2, H 2 O, molecole organiche più ossidate di quelle di partenza) 13 RUOLO DELL ATP NEL METABOLISMO È un derivato dell AMP (adenosin monofosfato) al quale sono legati altri 2 gruppi fosforici per mezzo di legami anidride ( ADP + Pi + energia = ATP ) fosfato inorganico I legami anidride sono legami ricchi di energia e quindi sono particolarmente reattivi - L ATP è in grado di cedere gruppi fosforici a numerosi intermedi metabolici, convertendoli nella forma attivata con livelli di energia libera tali da consentire a questi intermedi fosforilati di partecipare alle reazioni biosintetiche, che sono termodinamicamente favorevoli ( G <0) - Una analoga reazione con un reagente in forma non fosforilata sarebbe termodinamicamente sfavorevole ( G >0) La generazione di ATP è quindi necessaria per il funzionamento dei processi biosintetici 14
Come ottengono ATP i microrganismi? RESPIRAZIONE: sintesi di ATP attraverso il sistema enzimatico della Fo-F1 ATP sintasi (o Fo-F1 ATPasi), al termine della catena di trasporto degli elettroni Lettera O, non numero zero! FOTOFOSFORILAZIONE: sintesi di ATP attraverso l impiego di energia luminosa per creare una separazione di cariche FOSFORILAZIONE A LIVELLO DI SUBSTRATO: consiste nel diretto trasferimento di un fosfato ad alto contenuto energetico da un composto fosforilato ad ADP per formare ATP 15 REAZIONI di OSSIDO-RIDUZIONE - donatore di e - (agente riducente che si ossida!) - accettore di e - (agente ossidante che si riduce!) il valore del potenziale di RIDUZIONE è un indice di quanto la molecola in oggetto sia un buon donatore o un buon accettore di e - 2H + /H 2 O 2 /H 2 O - 0.42 V (infatti H 2 è un ottimo donatore di elettroni) + 0.82 V (infatti O 2 è un ottimo accettore di elettroni) per OGNI composto che si OSSIDA in una semireazione DEVE esserci un composto che si RIDUCE in un altra semireazione ad essa accoppiata H 2 2H + + 2 e - (semireazione 1) ½ O 2 + 2H + + 2 e - H 2 O (semireazione 1) REAZIONE NETTA H 2 + ½ O 2 H 2 O 16
REAZIONI di OSSIDO-RIDUZIONE - donatore di e - (agente riducente che si ossida!) - accettore di e - (agente ossidante che si riduce!) il valore del potenziale di RIDUZIONE è un indice di quanto la molecola in oggetto sia un buon donatore o un buon accettore di e - 2H + /H 2 O 2 /H 2 O - 0.42 V (infatti H 2 è un ottimo donatore di elettroni) + 0.82 V (infatti O 2 è un ottimo accettore di elettroni) per OGNI composto che si OSSIDA in una semireazione DEVE esserci un composto che si RIDUCE in un altra semireazione ad essa accoppiata H 2 2H + + 2 e - (semireazione 1) ½ O 2 + 2H + + 2 e - H 2 O (semireazione 1) REAZIONE NETTA H 2 + ½ O 2 H 2 O 17 Nei sistemi biologici le reazioni di ossido-riduzione UTILI ai fini energetici avvengono quando l e - e il protone (H + ) che lo segue sono rimossi da un substrato (per azione di un enzima) per essere trasferiti ad un TRASPORTATORE che agirà come intermedio di trasporto tra un donatore e un accettore associati ai protoni!!! Gli e - non esistono allo stato libero nei sistemi biologici MA SI SPOSTANO DA DONATORI AD ACCETTORI ATTRAVERSO LA MEDIAZIONE DI TRASPORTATORI FISSI LIBERI NAD + reazioni CATABOLICHE NADP + reazioni ANABOLICHE Associati alla membrana cofattori di enzimi responsabili delle deidrogenazioni per esempio lattato deidrogenasi Lattato + NAD + riduzione del NAD ossidazione del NAD NADH + H + + Piruvato 18
NICOTINAMIDE ADENIN DINUCLEOTIDE FORMA OSSIDATA (NAD + ) NICOTINAMIDE ADENIN DINUCLEOTIDE FORMA RIDOTTA (NADH + H + ) NICOTINAMIDE ADENINA NICOTINAMIDE ADENINA RIBOSIO 2 FOSFATI RIBOSIO RIBOSIO 2 FOSFATI RIBOSIO Quando il NAD in forma ossidata (NAD + ) acquista 2 elettroni, cioè si riduce, acquista anche un H + e un H + viene rilasciato nel citoplasma per questo il NAD in forma ridotta deve essere indicato come NADH + H + 19 Che bisogno c è, da un punto di vista metabolico, di due piridinnucleotidi (NAD e NADP) così simili a livello funzionale? RISPOSTA: i piridinnucleotidi ossidati entrano come reagenti nei processi catabolici, mentre quelli in forma ridotta partecipano ai processi biosintetici Ciò significa che: - i piridinnucleotidi si devono trovare per lo più in forma ossidata perché i processi catabolici possano funzionare - per le reazioni biosintetiche si devono trovare in gran parte in forma ridotta SONO QUINDI NECESSARI DUE TIPI DI piridin-nucleotidi Il NAD è mantenuto largamente nello stato ossidato interviene quindi nelle reazioni cataboliche (è importante ricordarlo per quando parleremo della fermentazione) Il NADP è mantenuto largamente nello stato ridotto interviene quindi nelle reazioni anaboliche 20