1 I microrganismi eucariotici Cap. 12 e appunti della lezione
2 microrna
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4 Organismo # bp # geni Escherichia coli 4,600,000 4288 Saccharomyces cerevisiae 13,000,000 5885 Caenorhabditis elegans ~100,000,000 ~14,000 Arabidopsis thaliana ~120,000,000 ~10,000 Drosophila melanogaster ~170,000,000 ~12,000 humans ~3,400,000,000 ~25,000?
5 Funghi Alcune caratteristiche dei microrganismi eucariotici Unicellulari o multicellulari Eterotrofi Chemioorga notrofi Generalmente non mobili Alghe Unicellulari o multicellulari Autotrofi Fototrofi Generalmente non mobili Protozoi Unicellulari Eterotrofi Chemioorga notrofi Generalmente mobili
Alcune intossicazione causate da micotossine fungine in animali domestici 6 Malattia Funghi Micotossina Alimento contaminato Aflatossicosi Aspergillus flavus Aflatossina Riso, mais, cereali, sorgo, arachidi, soia Ergotismo Avvelenamento da funghi Claviceps purpurea Alcaloidi dell ergotina Semi di molte graminacee, granaglie Amanita verna Amanite Ingestione con foraggio Animale colpito Pollame, suini, bovini, ovini, cani Bovini, equini, suini e pollame Bovini Sindrome emorragica del pollame Aspergillus flavus ed altri Aflatossine Scialorrea Rhizoctonia Alcaloide slaframina Granaglie e mandorle tossiche Trifoglio violetto Pollame Bovini, ovini Tossicosi da festuca arundinacea Acremonium coelophiarum Sconosciuta Piante di festuca arundinacea infestate da endofiti Bovini
Principali acidi organici prodotti attraverso processi microbiologici Prodotto Microorganismo Utilizzazione Condizioni di fermentazione Acido acetico Acido citrico Acido fumarico Acido gluconico Acido iataconico Acido coico Acetobacter con soluzioni di etanolo Aspergillus niger in terreni a base di melassa Rhizopus nigricans in terreni a base di zuccheri Aspergillus niger in un terreno con glucosio e sali minerali Aspergillus terreus in terreni con sali e melassa Aspergillus flavus-oryzae in terreni con carboidrati e azoto inorganico Acido lattico Lactobacillus delbrueckii omofermentativo Produzione di antibiotici: Larga varietà di usi alimentari Prodotti farmaceutici, come additivo nei cibi Produzione di resine, tinture e colle Un carrier per il calcio e il sodio Gli esteri possono essere polimerizzati per formare sostanze plastiche Produzione di fungicidi e insetticidi se complessato con metalli Come carrier per il calcio e come acidificatore penicillina, griseofulvina (Penicillium), cefalosporina (Cephalosporium) Ossidazione a singolo stadio con produzione di soluzioni al 15% con rese del 95-99% Alte conc. carboidrati e limitazione controllata di metalli in tracce, rese 60-80% Ferm. fortemente aerobica, critico il rapporto carbonio-azoto, lo zinco dovrebbe essere limitato, rese del 60% Si utilizza la fermentazione con agitazione, rese del 95% Fermentazione altamente aerobica, ph inferiore a 2.2, rese dell 85% Il Fe deve essere altamente controllato per evitare la reazione con l acido coico durante la fermentazione Terreno purificato per facilitare l estrazione 7
8 I funghi I funghi sono organismi eucariotici chemioorganotrofi; la maggior parte sono aerobi. Da un punto di vista fisiologico sono molto versatili e possono tollerare condizioni ambientali estreme (alte e basse temperature, alte concentrazioni di zuccheri, ph acidi). La maggior parte dei funghi sono pluricellulari filamentosi, ma vi sono funghi unicellulari (lieviti) e funghi che alternano la forma filamentosa a quella unicellulare a seconda delle condizioni di nutrizione e temperatura. Tale dimorfismo è comune a molte specie patogene come per esempio Candida. Il tallo di un fungo è costituito da filamenti tubulari dal diametro compreso tra 3-10 µm denominati ife. Un aggregato di ife è chiamato micelio. A volte si possono distinguere un micelio vegetativo, immerso nel terreno di coltura, e un micelio aereo, (ife che emergono nell aria e spesso specializzate per la formazione di spore vegetative o sessuali.
9 Parete cellulare dei funghi La parete cellulare è composta per l 80-90% del suo peso da polisaccaridi, la restante parte comprende proteine e lipidi. La rigidità è dovuta alla presenza di microfibrille tenute assieme da una matrice amorfa. Chitina e cellulosa sono i componenti più comuni. Nei lieviti sono presenti glucani e mannani
10 Le ife possono essere: A) non settate (cenocitiche). Presenti nei Ficomiceti. B) settate con cellule uninucleate; i setti si originano per accrescimento centripeto; in alcuni funghi il setto presenta un poro centrale di 0,4-1µm attraverso il quale il citoplasma e i nuclei possono migrare da compartimento ad un altro C) Settate con cellule plurinucleate
11 Crescita polarizzata dell ifa (http://helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/apical.htm#crest) Le ife dei funghi si estendono continuamente sulla punta, dove gli gli enzimi sono rilasciati nell ambiente e dove sono sintetizzati i materiali nella nuova parete. Il tasso di estensione della punta può essere molto rapido - fino a 40 micrometri per minuto. La crescita apicale è una caratteristica distintiva dei funghi che gli consente di estendersi in zone fresche di substrato. Questo è particolarmente importante per la crescita su polimeri insolubili come la cellulosa in quanto gli enzimi rilasciati dalle ife hanno un tasso di diffusione limitato. Questi enzimi,creano zone di erosione attorno all ifa, ma la punta può continuare a crescere oltre queste zone dove i nutrienti sono esauriti. La crescita apicale consente ai funghi di inserirsi nella parete cellulare delle piante e la cuticola degli insetti.
12 L organizzazione ultrastrutturale dell ifa fornisce importanti informazioni sulla crescita apicale. La punta estrema di un ifa in crescita possiede un corpo apicale definito Spitzenkörper che consiste in un raggruppamento di piccole vescicole membrana-legate avvolte da microfilamenti di actina.
13 Si pensa che le vescicole apicali che formano lo Spitzenkörper siano prodotte nel Golgi e quindi trasportate nella punta da elementi del citoscheletro. (microtubuli, microfilamenti di actina e miosina). Le vescicole quindi si fondono con la membrana plasmatica e rilasciano il loro contenuto che può essere costituito da. enzimi coinvolti nella sintesi della parete enzimi coinvolti nella degradazione della parete enzimi attivatori alcuni polimeri della parete come le mannoproteine
E chiaro che il processo di crescita alla punta dell ifa è estremamente complesso, con molti componenti che si devono coordinare. Qualunque cambiamento o sbilanciamento di questi componenti può alterare la forma della punta dell ifa o la direzione di crescita. 14 Figure A. Tip growth of fungal hyphae. These three images from a videotape sequence were taken over a period of 20 minutes after a glass coverslip was placed on the margin of a colony of Neurospora crassa. The left-hand image is typical of a hypha, with extension growth at the hyphal apex, and branches arising from points behind the main apex. The addition of a coverslip disturbs the normal tip growth, causing several branches to emerge from the existing tips (centre and right-hand images).
15 Coltivazione delle muffe Quasi tutte le muffe crescono su comuni terreni batteriologici a temperature comprese tra 20 e 30 C. La crescita è più lenta rispetto ai batteri; per favorire la crescita delle muffe si possono utilizzare terreni acidi (ph 5,6) contenenti una concentrazione di zucchero piuttosto alta. In queste condizioni la crescita di molti batteri viene inibita. Esistono tre tipi generali di terreni per la coltivazione delle muffe: 1. Terreni sintetici o chimicamente definiti 2. Terreni colturali preparati con peptoni, estratti vegetali, agar 3. Terreni naturali come infusi di frutta, cereali ortaggi.
Principali componenti dei terreni di crescita usati nelle fermentazioni industriali 16 FONTE Carbonio ed energia Azoto Vitamine Ferro, tracce di sali Tamponi Agenti antischiumogeni MATERIALE GREZZO Melassa, siero di latte, granaglie, prodotti di scarto dell agricoltura (pannocchie) Liquame di macerazione del mais, farina di soia, fluidi animali (prodotti dal mattatoio), ammoniaca e sali d ammonio, nitrati, prodotti solubili di distilleria Preparazioni grezze di prodotti animali e piante Sostanze chimiche inorganiche grezze Carbonati gessosi o grezzi, fosfati per fertilizzazione Alcoli ad alta gradazione, siliconi, esteri naturali, lardo, oli vegetali
17 Crescita delle forme filamentose Terreni solidi Se si semina una sospensione di spore in un punto su un terreno solido, si forma una grossa colonia circolare che compare dopo pochi giorni e continua ad ingrandirsi con velocità che dipende da caratteristiche della specie. Si possono distinguere tre fasi principali: fase di latenza fase di crescita fase di invecchiamento Se la semina è stata fatta con spore, la fase di latenza è dovuta alla loro germinazione; se invece è stata fatta con micelio, è dovuta alla rigenerazione delle ife spezzate o a cambiamenti dell ambiente. La velocità della crescita dipenderà dalla natura e la quantità delle sostanze nutritive, dal ph, dalla pressione osmotica, dalla temperatura, dall O 2, dalla CO 2 e dall umidità relativa dell atmosfera interna della piastra. Nella terza fase (invecchiamento) si osserva che le ife ai bordi della colonia crescono ancora un po, ma in modo irregolare. In molte specie si ha autolisi al centro della colonia
18 Crescita delle forme filamentose Terreni liquidi Essendo dei microrganismi aerobi, in terreno liquido hanno la tendenza a crescere in superficie e formano così miceli molto spessi (feltri) non omogenei in quanto tra la parte che si sviluppa a contatto con il liquido e quella più a contatto con l aria si crea un gradiente fra una condizione anaerobica e una aerobica. Coltura sommersa: è necessario provvedere al fabbisogno di ossigeno. Ciò viene ottenuto mediante insufflamento di aria accompagnato da una forte agitazione. In questo modo si formano dei miceli frammentati in piccole palline (pellets). La grandezza dei pellets è controllata da vari fattori quali la diffusione dell ossigeno, delle sostanze nutritive il ph ecc. La preparazione dei pellets richiede quindi un ottimizzazione e può avere una notevole influenza sulle rese dei prodotti finali. Influenza dell ossigeno nei processi di produzione Acido citrico ++++ O 2 Aspergillus niger Amilasi + O 2
19 Riproduzione sessuale Le spore sessuali si trovano allo stato aploide e prendono nomi diversi a seconda del gruppo al quale appartengono i funghi stessi. In uno schema generale, due gameti si fondono formando lo zigote diploide che accrescendosi formerà l individuo adulto. Nella maggior parte degli eucarioti, alla fusione del citoplasma (plasmogamia) segue immediatamente la fusione dei nuclei (cariogamia). Nei funghi, plasmogamia e cariogamia possono essere separate da molte divisioni cellulari. Due nuclei aploidi nello stesso citoplasma formano un dicarion. La riproduzione può avvenire per anisogamia isogamia oogamia contatto tra gametangi (uno o più nuclei passano da un gametamgio maschile a uno femminile per contatto somatogamia: fusione di cellule somatiche o ife non seguite da cariogamia Funghi omotallici: presentano i due tipi di cellule sessuali sullo stesso tallo Funghi eterotallici: la riproduzione sessuale avviene tra gameti derivati da individui diversi
Riproduzione nei funghi 20 mitosi Il ciclo vitale è per la maggior parte del tempo aploide (n) n n+n Plasmogamia 2n Meiosi n n+n 2n Cariogamia
Riproduzione nei funghi 21 mitosi Il ciclo vitale è in predominanza dicarion (n + n) n + n Cariogamia 2n n n + n Plasmogamia 2n n Meiosi
Riproduzione nei funghi 22 mitosi Il ciclo vitale è in predominanza diploide (2n) 2n Meiosi n n + n 2n Cariogamia n n + n Plasmogamia
Riproduzione vegetativa Le spore si formano da un ifa aerea che si differenzia in una struttura denominata corpo fruttifero o sporoforo. I principali tipi di spore sono rappresentati nella figura. artrospore: si formano per segmentazione dell ifa blastospore: si formano per esocrescita lungo le ife settate clamidiospore: si formano lungo l ifa o ad un estremità conidiospore: si formano all estremità di conidiofori derivanti da ife settate sporangiospore: si producono entro lo sporangio all estremità di corpi fruttiferi (sporangiofori) derivanti da ife non settate 23
24 Caratteristiche distintive di alcuni gruppi di funghi Gruppo Esempio Habitat Caratteristiche morfologiche Riproduzione vegetativa Riproduzione sessuale Phycomycetes Chytridiomycete s e Oomycetes Phytophthora infestans Acqua, suolo Unicellulari o filamentosi, settati o non settati Zoospore flagellate Oospore Zygomycetes Rhyzopus stolonifer (muffa nera del pane) Suolo filamentosi Sporangiospore Zigospore Ascomycetes S. cerevisiae Frutta, materia organica Unicellulare Gemmazione Ascospore N. crassa Suolo Filamentosi micelio settato Conidi su conidiofori Ascospore Basidiomycetes Agaricus campestris (prataiolo) Suolo Filamentosi micelio settato Generalmente assente Basidiospore Deuteromycetes Aspergillus, Penicillium Suolo Unicellulari e filamentosi micelio settato Gemmazione o conidi su conidiofori Generalmente assente
25 Rhizopus
26 Divisione Zygomycota La maggior parte vive su materia animale e vegetale in decomposizione nel suolo. Presentano ife cenocitiche con molti nuclei aploidi. Un membro di questa divisione è la muffa del pane Rhizopus stolonifer. Sul pane ife specializzate denominate rizoidi, si estendono all interno e assorbono le sostanze nutritive; altre ife denominate stoloni, si inarcano all indietro e formano nuovi rizoidi; altre ancora si erigono a formare gli sporangiofori. Rhizopus viene utilizzato in Indonesia per produrre il tempeh (alimento ottenuto con la bollitura di soia sbucciata). Mucor viene usato con la soia per produrre il sofu (formaggio) Vengono inoltre utilizzati per la produzione di enzimi amilolitici a pectinasi Altri zigomiceti vengono impiegati nella preparazione di anestetici, alcoli industriali, di preparati per rendere tenera la carne e di coloranti gialli per surrogati del burro e della margarina. Rhizopus si riproduce per via vegetativa, ma in condizioni ambientali sfavorevoli adotta la riproduzione sessuata
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28 Divisione Ascomycota A questo gruppo appartengono numerosi funghi unicellulari, filamentosi e dimorfici. Le forme filamentose hanno il micelio settato. Molte specie sono economicamente importanti. Molte delle muffe che deteriorano i cibi sono ascomiceti. Lo stesso per il malbianco che attacca le foglie delle piante, il cancro del castagno e la moria dell olmo. Anche le morchelle e i tartufi sono ascomiceti. Anche il lievito S. cerevisiae, usato in molti processi biotecnologici e come modello di studio di cellule eucariotiche, appartiene a questa divisione.
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Claviceps purpurea parassita la segale ed altre graminacee provocando la malattia della segale cornuta. L ergotismo, l intossicazione degli uomini e degli animali che hanno ingerito granaglie infettate dal fungo, è spesso accompagnato da cancrena, allucinazioni psicotiche, aborto, convulsioni. Durante il Medioevo uccise migliaia di persone. Si pensa che le accuse di stregoneria in alcune comunità del Massachusetts nel 1690 possano essere state determinate da un epidemia di ergotismo. Le attività farmacologiche dell ergotina sono dovute al suo principio attivo, la dietilammide dell acido lisergico (LSD). In dosi controllate l ergotina può essere usata per provocare le doglie del parto, abbassare la pressione del sangue e calmare le emicranie. 30
Divisione Basidiomycota 31
32 Divisione Deuteromycota Quando un fungo non ha la fase sessuale (forma perfetta) oppure questa non è mai stata osservata, esso viene inserito nella divisione Deuteromycota. Molti dei funghi che erano stati includi nei Deuteromiceti, in seguito alla scoperta del loro ciclo sessuale sono risultati essere Ascomiceti o Basidiomiceti. In buona parte i Deuteromiceti sono patogeni e causano malattie come il piede d atleta e la tigna. In questa divisione si trovano anche molte muffe importanti per l industria. Penicillium: produzione di antibiotici penicillina e griseofulvina, conferimento profumi caratteristici di formaggi come il gorgonzola, il camembert e i roquefort Aspergillus: impiegati nella fermentazione delle salsa di soia, produzione di acido citrico gluconico e gallico. Aspergillus flavus e A. parasiticus producono dei metaboliti secondari denominati aflatossine che sono fortemente tossici e cancerogeni
33 Penicillium
34 Aspergillus niger
Aspergillus flavus 35 http://www.doctorfungus.org Genus/Species: Aspergillus flavus Title: Stages in development of fruiting bodies Image Type: MicroLaboratory Disease(s): Zygomycosis Legend: Stages in development of fruiting bodies. Differential interference contrast microscopy, 630X.
36 Ciclo parasessuale in Aspergillus La presenza di un ciclo parasessuale è molto importante poiché permette di studiare la genetica anche di organismi in cui manca la riproduzione sessuale 1) fusione tra due ife con formazione di un eterocarion; l eterocarion è abbastanza stabile ed i nuclei non interagiscono 2) in rari casi si ha la fusione nucleare con formazione di nuclei diploidi 3) può avvenire un crossing over mitotico
37 Crossing over mitotico Normalmente durante la mitosi i cromosomi omologhi non vanno incontro a sinapsi e crossing over, come accade nella meiosi, ma si allineano abbastanza spesso da subire qualche raro scambio genetico. Nel caso IV, il diploide esprimerà i fenotipi recessivi b e c I III II IV
38 Appaiamento somatico dei cromosomi e ricombinazione durante la mitosi. 1) nucleo diploide con una coppia di cromosomi omologhi, eterozigote per tre geni 2) crossing-over tra due cromatidi nella regione compresa tra A e B 3) i quattro possibili nuclei derivanti da (2). 4) l aploidizzazione non avviene tramite meiosi, ma tramite distribuzione casuale dei cromosomi nei nuclei della progenie. Questo fenomeno che avviene spontaneamente con una frequenza di 10-3 può essere indotto con p-fluoro fenilalanina.
Aploidizzazione a causa della 39 non disgiunzione mitotica In questo esempio è considerato un microrganismo con un solo cromosoma. In questo caso, l ipoploide prodotto è già l aploide. Nel caso in cui ci sia più di un cromosoma, l ipoploide (molto instabile) continua a espellere cromosomi fino al raggiungimento di un numero aploide stabile di cromosomi Ipoploide Iperploide Disgiunzione mitotica normale Non disgiunzione dei due cromatidi in alto
Aploidizzazione a causa della 40 non disgiunzione mitotica Ipoploide Iperploide Disgiunzione mitotica normale Non disgiunzione dei due cromatidi in alto
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