DNA -Come è stato scoperto -Quali sono le sue funzioni Il DNA è il materiale ereditario e non le proteine Esperimento di Griffith 1928 Streptococcus pneumoniae S(smooth) capsulato virulento R(rough) acapsulato non-virulento Il ceppo S, detto anche liscio dal momento che produce colonie lisce e lucenti (grazie alla presenza di una capsula batterica polisaccaridica che avvolgeva ogni cellula). Questo ceppo è in grado di provocare la polmonite. Il ceppo R, detto anche rugoso dal momento che produce colonie dall'aspetto "rugoso" (a causa dell'assenza della capsula batterica). Questo ceppo non è in grado di provocare polmonite. Utilizzando il calore sterilizzò la soluzione contenente lo pneumococco letale (S) con capsula, mescolò la soluzione così ottenuta con quella contenente lo pneumococco privo di capsula (R) non letale. Esaminando successivamente le colonie ottenute da batteri della soluzione finale, verificò la presenza del solo ceppo capsulato letale. L informazione genetica era passata da un ceppo all altro (trasformazione ) gli R ricostruivano la capsula 1
Secondo esperimento Per il secondo esperimento Griffith utilizzo sempre i due ceppi di Streptococcus pneumoniae : il ceppo (R) privo di capsula e non letale ed il ceppo (S) capsulato e letale; come cavia nella quale iniettare i batteri utilizzo il topo. Esegui quattro distinte inoculazioni: Prima inoculazione - iniettando nel topo il ceppo vivo privo di capsula (R) il topo vive Seconda inoculazione - iniettando nel topo il ceppo vivo capsulato (S) il topo muore Terza inoculazione - iniettando nel topo il ceppo morto capsulato (S) il topo vive Quarta inoculazione - iniettando nel topo il ceppo vivo privo di capsula (R) insieme al ceppo morto capsulato (S) il topo muore, inoltre esaminando il tipo di batteri presenti nel topo morto Griffith riscontrò il ceppo letale (S). Questo esperimento dimostrò che i batteri sono in grado di trasferire informazioni genetiche attraverso un processo noto come trasformazione PRINCIPIO TRASFORMANTE 2
IDENTIFICAZIONE DEL PRINCIPIO TRASFORMANTE O.T. Avery 1944 Ripetè l esperimento di Griffith Batteri patogeni S con capsula uccisi dal calore + -DNasi -RNasi -Proteasi Il topo non moriva quando veniva iniettato con batteri R mescolati a batteri S precedentemente trattati con DNasi Critiche da parte della comunità scientifica (Proteine / Dna) 3
Esperimento di Avery Avery si procurò una coltura di pneumococchi di tipo S. A questo punto lisò le cellule (cioè ne ruppe la parete e la membrana cellulare) in modo da ottenere una soluzione nella quale era disciolto il materiale contenuto nei batteri, il cosiddetto estratto cellulare o lisato cellulare. Per capire quale delle due sostanze fosse ( se DNA o RNA) coinvolta ne trasferimento di materiale genetico, divise l'estratto in due aliquote: -una venne trattata con l'enzima ribonucleasi (RNasi) che degrada selettivamente l'rna e non il DNA, -l'altra venne invece trattata con desossiribonucleasi (DNasi) che degrada selettivamente il DNA e non l'rna. Ciò che si osservò era la trasformazione dei batteri R in batteri S solo in seguito all'aggiunta dell'aliquota trattata con RNasi. Il materiale genetico doveva allora essere necessariamente il DNA. 4
Premesse per esperimento di Hershey-Chase 1952 Quando una cellula batterica Viene infettata da un virus Solo il DNA del virus entra 5
6
Esperimento di Hershey-Chase 1952 Il processo utilizzato per determinare se la radioattività provenisse dall'interno o dall'esterno delle cellule fu il seguente: -dopo un certo tempo dall'inizio dell'infezione, il terreno di coltura veniva posto in un omogenizzatore. La conseguente agitazione provocava il distacco del rivestimento proteico dei virus dalla membrana cellulare (in questo caso si parla di "ombre fagiche" poiché questi rivestimenti proteici non contengono il DNA che è già stato iniettato nella cellula). Il tutto veniva poi centrifugato: la parte cellulare (contenente eventualmente il DNA marcato) rimaneva sul fondo della provetta, mentre i rivestimenti proteici distaccati dalle membrane cellulari rimanevano in sospensione. A seconda di dove si misurava la maggiore radioattività era possibile dedurre se la molecola marcata si trovasse o meno all'interno della cellula. IL DNA è IL MATERIALE EREDITARIO 7
Dogma centrale della BIOLOGIA 8
Acidi nucleici DNA(acido desossiribonucleico), RNA (acido ribonucleico) Catene polinucleotidiche Unità base NUCLEOTIDE: BASE AZOTATA+ZUCCHERO (ribosio nel caso dell RNA, desossiribosio nel caso del DNA) +FOSFATO NUCLEOSIDE BASE AZOTATA+ZUCCHERO Denaturazione ( rottura legami H)e rinaturazione 9
DNA = lungo polimero costituito da unità ripetute di nucleotidi. Ogni filamento può contenere diversi milioni di nucleotidi. Ad esempio, il più grande cromosoma umano (il cromosoma 1) contiene quasi 250 milioni di paia di basi. Negli organismi viventi, il DNA non è quasi mai presente sotto forma di singolo filamento, ma come una coppia di filamenti saldamente intrecciati tra loro, a formare una struttura definita doppia elica. Ogni nucleotide è costituito da uno scheletro laterale, che ne permette il legame covalente con i nucleotidi adiacenti, e da una base azotata, che instaura legami idrogeno con la corrispondente base azotata presente sul filamento opposto. La struttura laterale del DNA è composta da unità ripetute ed alternate di gruppi fosfato e di 2-deossiribosio, uno zucchero pentoso (a cinque atomi di carbonio) che si lega ai fosfati adiacenti attraverso legami fosfodiesterici presso il terzo ed il quinto carbonio. Conseguenza di questi legami asimmetrici è che ogni filamento di DNA ha un senso, determinato dalla direzione dei legami fosfodiesterici. In una doppia elica, il senso di un filamento è opposto a quello del filamento complementare. Per tale motivo, i due filamenti che costituiscono una doppia elica sono detti antiparalleli. Le estremità asimmetriche di un filamento di DNA sono definite estremità 5 (cinque primo) ed estremità 3 (tre primo). La principale differenza tra il DNA e l'rna è lo zucchero pentoso utilizzato: l'rna, infatti, utilizza il ribosio. La doppia elica del DNA è stabilizzata dai legami idrogeno che si instaurano tra le basi azotate presenti sui due filamenti. Campbell-Reece, Biologia 2009 Pearson Paravia Bruno Mondadori S.p.A Figura 16.5 10
La struttura a doppia elica del DNA consente di portare l informazione e di autoreplicarsi: I nucleotidi si legano con legame fosfodiestereo in direzione 3 OH 5 P Estremità 3 OH libera Estremità 5 fosfato Watson e Crick (1953) ipotizzarono che la molecola di DNA fosse costituita da 2 catene polinucleotidiche antiparallele tenute insieme da legami ad idrogeno tra le basi 11
Campbell-Reece, Biologia 2009 Pearson Paravia Bruno Mondadori S.p.A Figura 16.7 12
Dati cristollografici R. Franklin (Londra, 25 luglio 1920 Londra, 16 aprile 1958 ) e M. Wilkins Scoperta: due diverse strutture del DNA. Quando è bagnato il DNA assume una struttura lunga e sottile (A); quando è asciutto invece diventa corto e grosso (B). 13
1950 Chargaff Tutte e quattro le basi hanno struttura eterociclica -ma adenina e guanina sono, dal punto di vista strutturale, derivate della purina, e pertanto dette basi puriniche, -mentre citosina e timina sono correlate alla pirimidina e dette basi pirimidiniche. Esiste una quinta base, di tipo pirimidinico, chiamata uracile (U), ma essa non è di norma presente nelle catene di DNA. L'uracile è altresì presente nei filamenti di RNA al posto14della timina
Campbell-Reece, Biologia 2009 Pearson Paravia Bruno Mondadori S.p.A Figura 16.8 15
DNA B Watson e Crick 1953 Elica a doppio filamento Diametro uniforme 2 nm Complementarietà fra le basi Elica destrorsa Filamenti antiparalleli 16
LEGAME FOSFODIESTEREO FRA DUE NUCLEOTIDI 17
Premesse per replicazione 18
19
Ipotesi per replicazione DNA 20
Meselson e Stahl 21
Per iniziare la replicazione, occorre anzitutto -l'apertura della forca replicativa, attraverso la parziale denaturazione del DNA a doppia elica, grazie a elicasi e dalle single-strand-binding proteins (SSBPs): : le elicasi sono enzimi che separano attivamente i due filamenti usando l'energia dell'atp; le SSBPs sono in grado di mantenere la denaturazione del DNA legandosi esclusivamente alle porzioni a singolo filamento e stabilizzandole. Nelle molecole di DNA circolari dei procarioti si ha una sola regione di origine della replicazione dalla quale partono due forche replicative (la struttura prende il nome di bolla di replicazione). Quando le due forche si incontrano dal lato opposto la replicazione è completata. Negli eucarioti la replicazione di ogni cromosoma inizia invece in più punti 22
DNA batterico 23
DNA eucariotico 24
25
Le eliche del DNA devono essere tenute separate durante la replicazione DNA elicasi, topoisomerasi e proteine destabilizzatrici dell elica La sintesi procede in direzione 5 3 la DNA polimerasi forma legami fosfodiesterei tra il 3 OH della catena in allungamento ed il 5 P di un nuovo nucleotide La sintesi necessita di un iniziatore di RNA Primasi La DNA polimerasi non è in grado di iniziare la sintesi di un filamento ex novo, mentre può allungare un filamento polinucleotidico preesistente. In una cellula in replicazione, dunque, è indispensabile la presenza di un filamento preesistente (detto primer), che consiste solitamente in un breve segmento di RNA complementare allo stampo, sintetizzato da enzimi specifici detti primasi. La sintesi avviene in modo Continuo Discontinuo frammenti di Okazaki Deossiribonucleosidi trifosfati (datp, dctp, dgtp, dttp) 26 Ligasi
27
Dalla Bolla di replicazione.. Dal momento che le DNA polimerasi sono in grado di svolgere la loro attività solo in direzione 5'-3', esse hanno messo a punto diversi meccanismi per copiare i due filamenti della doppia elica. Un filamento (chiamato filamento guida) può essere replicato in modo quasi continuo, man mano che viene esposto, -l'altro (filamento lento) risulta invece disseminato da brevi filamenti di DNA di nuova sintesi (i frammenti di Okazaki), ognuno dei quali presenta un innesco iniziale di RNA. I nuovi filamenti devono essere quindi completati mediante la rimozione degli inneschi da parte di endonucleasi e il riempimento degli spazi rimasti ad opera di polimerasi di riparazione. Successivamente tutti questi frammenti di DNA di nuova sintesi del filamento lento vengono legati 28 dalle DNA ligasi.
29
4 1 5 2 3 In realtà quasi tutti i passaggi sono svolti da un unico ed enorme complesso proteico di più di 1.000 kda che si associa al DNA e lo fa scorrere sintetizzandolo, esso comprende le elicasi, le polimerasi e così via. 30
31
32
DNA polimerasi II: correttore delle bozze Altrimenti: mutazioni puntiformi alleli 33
Dogma della Biologia 34