Università degli Studi di Siena Facoltà di Scienze matematiche Indagini genetiche su sette specie di cetacei del Mar Mediterraneo e del Mar di Cortez. Valutazione dello stato ecotossicologico di esemplari di capodoglio ( Physiter macrocephalus). di Ivana Donadio Relatore: Letizia Marsili A. A. 2009-2010
1.RIASSUNTO Il principale scopo di questa tesi è stato quello di mettere a punto la tecnica molecolare della PCR per la valutazione genetica del sesso su 95 campioni di epidermide campionata tramite biopsia cutanea da esemplari free-ranging di 7 specie differenti di Cetacei, secondo il metodo descritto da Bérubé e Palsboll (1996). La validazione della tecnica è stata effettuata confrontando i risultati delle PCR dei free-ranging con quelli di esemplari spiaggiati di sesso noto. Le 7 specie di Cetacei, campionate sia nel Mar di Cortez che nel Mar Mediterraneo, sono le seguenti: capodoglio (Physeter macrocephalus), orca (Orcinus orca), stenella striata (Stenella coeruleoalba), delfino comune (Delphinus delphis), tursiope (Tursiops truncatus), balenottera comune (Balaenoptera physalus), balenottera di Bryde (Balaenoptera edeni). Inoltre è stato possibile indagare sullo stato tossicologico di alcuni esemplari di capodoglio spiaggiati e free-ranging, valutando i livelli di alcuni composti Organoclorurati (OCs) e degli Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA) accumulati nel grasso sottocutaneo ( bubbler ). Gli esemplari di capodoglio esaminati sono stati campionati nel Mar di Cortez (free-ranging) e nel Mar Mediterraneo (spiaggiati e free-ranging). Inoltre, in virtù della determinazione del sesso dei campioni è stato possibile effettuare un confronto intraspecifico sulle differenze di accumulo degli inquinanti tra i maschi e le femmine dei capodogli. 4
2.ABSTRACT The main aim of this work of thesis was to develop and validate the molecular technique of Polymerase Chain Reaction (PCR) to determine genetically the gender of 95 skin samples, obtained from skin biopsies of free-ranging and stranded specimens of seven different species of cetaceans, using the method presented by Palsboll et al. (1996). The validation of this technique was performed comparing the results obtained from free-ranging specimens with those obtained from stranded specimens of known sex. The seven species of cetaceans, sampled in the Mediterranean Sea and in the Sea of Cortez, are: sperm whale (Physeter macrocephalus), killer whale (Orcinus orca), striped dolphin (Stenella coeruleoalba), longbeaked common dolphin (Delphinus capensis), bottlenose dolphin (Tursiops truncatus), fin whale (Balaenoptera physalus) and Bryde's whale (Balaenoptera edeni). It was also possible to evaluate the toxicological status of some free-ranging and stranded specimens of sperm whale, evaluating levels of some organochlorines compounds (OCs) and Polycyclic aromatic Hydrocarbons (PAHs) accumulated in subcutaneous adipose tissue (blubber). The samples of sperm whale were obtained in the Mediterranean Sea and in the Sea of Cortez. Moreover, thanks to the determination of the gender, it was possible to determine intraspecific differences of accumulation of these pollutants between different sex of sperm whale. 5
3. INTRODUZIONE La natura per migliorare la vita, questo è lo slogan con cui si apre il 2010: Anno Internazionale della Biodiversità. Il Summit mondiale a Rio de Janeiro (1993), ha definito la biodiversità come la variabilità fra tutti gli organismi viventi, inclusi ovviamente quelli del sottosuolo, dell aria, degli ecosistemi acquatici e terrestri. La diversità della vita è scindibile in tre sottolivelli: diversità degli ecosistemi (ambienti naturali quali acque, boschi, spazio alpino); diversità delle specie (animali, piante, funghi,microrganismi); diversità del patrimonio genetico (razze o varietà di specie selvatiche e domestiche). I tre livelli su cui si articola la diversità biologica sono strettamente connessi fra loro. Per sopravvivere le specie hanno bisogno di spazi vitali idonei e di una sufficiente variabilità genetica e gli ecosistemi hanno bisogno della varietà di specie che ospitano. Una buona interconnessione tra ambienti vitali è, a sua volta, indispensabile per la conservazione della varietà degli uni e degli altri. Un quarto livello è costituito dalla biodiversità funzionale, ovvero dalla diversità delle interazioni che si esplicano all interno e fra i tre livelli (www.biodiversita2010.ch). Il delicato equilibrio esistente sulla terra fra le specie vegetali e animali è frutto di oltre tre miliardi di anni di evoluzione, ogni specie animale e vegetale è adattato alle condizioni ambientali e locali. Se queste condizioni cambiano vi sono specie che si estinguono e habitat che scompaiono. L ultimo aggiornamento della Lista Rossa dell Iucn delle specie minacciate, indica che il 22% di tutti i mammiferi conosciuti è in pericolo, così come il 35% degli invertebrati, il 12% degli uccelli, il 28% dei rettili, e il 70% delle piante finora valutate. Viviamo una situazione molto preoccupante che, secondo alcune stime, indica un tasso globale di estinzione delle specie (causato dalle attività antropiche) circa 1000 volte superiore al tasso naturale di perdita (www.iucn.org ). L uomo, purtroppo, operando massicci interventi sulla natura ha in breve tempo fortemente modificato, danneggiato o addirittura distrutto molti ecosistemi attraverso uno sfruttamento delle risorse marine e terrestri o la frammentazione degli ambienti. Ma non solo, la lista dei danni provocati dall uomo è lunghissima di seguito ne elenco solo alcuni: l urbanizzazione del paesaggio e lo sparpagliamento degli habitat, lo sfruttamento agricolo, l alterazione del bilancio idrico, i mutamenti atmosferici e mutamenti climatici, l eutrofizzazione delle acque, l utilizzo di tecniche di pesca distruttive, l introduzione massiva di sostanze ad azione endocrina nelle acque, sfruttamento costiero e introduzione specie esotiche. 6
Perché è importante conservare la biodiversità marina e terrestre? La biodiversità costituisce la struttura degli ecosistemi e degli habitat che sono le risorse essenziali di sostegno alla vita, tra cui la fauna selvatica, la pesca e le foreste. E alla base della stessa vita umana, aiuta a provvedere ai bisogni umani fondamentali come il cibo, ad esempio circa il 16% del pesce è una fonte di apporto proteico per un individuo medio, per il riparo e per le medicine. A livello mondiale, è stimato che 200 milioni di persone vivono direttamente o indirettamente dalla pesca, e molti altri dipendono da ulteriori usi economici degli oceani e delle coste. Molti ecosistemi sono fonte primaria di ossigeno, arricchiscono il suolo e purificano l'acqua, ci proteggono da inondazioni e danni provocati dal maltempo e regolano il clima. I processi biologici essenziali per la perpetuazione della vita sulla terra hanno luogo grazie alle molteplici forme di vita esistenti terrestri e marine. L'ecosistema marino è fonte di inestimabile ricchezza, di biodiversità e di bellezza naturalistica. Il mare, con la sua fascia costiera e suoi fondali, costituiscono uno degli habitat più importanti e più ricchi, con la maggior variabilità animale del globo (www.contabilitaambientale.it). La vita dei nostri mari produce un terzo dell ossigeno che respiriamo. Alcuni esempi di habitat marini e costieri sono le foreste di mangrovie, barriere coralline, praterie marine. Tali habitat sono soggetti ad un equilibrio dinamico estremamente delicato, per cui qualsiasi intervento non adeguato o azioni invasive possono costituire elemento di disturbo, con conseguenze disastrose per l'ambiente e per l'economia del territorio. Le maggiori minacce per la biodiversità marina e costiera sono l'inquinamento (soprattutto provocato da fonti terrestri, ma anche da altre fonti), l'eccessivo sfruttamento delle risorse marine, l introduzione di specie estranee e il cambiamento climatico globale,l abusivismo edilizio, gli scarichi abusivi, la pesca illegale (www.contabilitaambientale.it). Tutti gli effetti negativi non sono solo immediati ma si ripercuoteranno con conseguenze ancor più gravi sulle generazioni future (www.contabilitaambientale.it). Una delle classi di animali a rischio in Europa e nel mondo è quella dei cetacei. I cetacei sono animali longevi, occupano i livelli più alti della piramide alimentare marina e si riproducono con grande lentezza e proprio per questi motivi sono particolarmente vulnerabili ad una serie di minacce derivanti dalle più disparate attività umane. Questi splendidi animali sono alle prese con numerosi problemi come l introduzione da parte dell uomo di prodotti chimici, cambiamenti climatici, speculazione edilizia delle coste, pesca indiscriminata, cementificazione delle coste, l inquinamento acustico, la navigazione commerciale e anche a causa dell introduzione di specie non-native (www.wdcs.org). Gli impatti del cambiamento climatico sui cetacei "sono sempre più incisivi e causano ogni anno modifiche sulla temperatura e sul livello del mare, sull acidità e sulla salinità dell'acqua causando la scomparsa in aree di particolare importanza delle 7
popolazioni di krill (banchi di piccoli crostacei che vivono sotto lo strato di ghiaccio polare e che rappresentano la principale fonte di cibo per molte popolazioni di balene) (www.wdcs.org). Nonostante le azioni promosse dalle convenzioni internazionali a favore della tutela dell ambiente marino, oggi sembra evidente che l esecutività di tali convenzioni è carente. E quindi indispensabile per svolgere un azione efficace, poter disporre di una valida base di informazioni per la loro protezione e la loro conservazione, dunque promuovere maggiormente l utilizzo delle tecniche di indagine che permettano di ottenere informazioni sul loro stato di salute tossicologica, apportando uno stress molto limitato sia al singolo individuo che alla popolazione. 3.1 Biodiversità cetologica nel mondo Nel mondo sono conosciute circa 78 specie di Cetacei: 21 di queste specie che sono state osservate nel Mediterraneo, non sono endemiche ma si tratta invece di specie che sono abbondantemente diffuse in tutti gli oceani del mondo. Di queste 21 specie, 8 sono specie residenti e di osservazione regolare mentre le altre 13 sono di comparsa occasionale in quanto rappresentate da individui che di tanto in tanto entrano nel Mediterraneo dall'oceano Atlantico e dal Mar Rosso. In generale, balene e delfini sono più abbondanti nelle porzioni occidentale e centrale del bacino, più vicine all'oceano Atlantico, mentre si fanno più rari nella porzione orientale e nel Mar Nero. Le specie regolarmente presenti nel Mediterraneo sono due specie di enormi dimensioni, la balenottera comune (Balaenoptera physalus) e il capodoglio (Physeter macrocephalus), 3 specie di delfini come il delfino comune (Delphinus delphis), il tursiope (Tursiops truncatus) e la stenella striata (Stenella coeruleoalba) e 3 specie poco conosciute di dimensioni intermedie quali: grampo (Grampus griso), globicefalo (Globicaphala melas) e zifio (Ziphius cavirostris). balene, delfini e focene sono conosciuti collettivamente con il nome di Cetacei (un Ordine della Classe mammiferi), derivante dalla latino Caetaceus (grande animale marino). Come tutti i mammiferi sono vertebrati omeotermi, respirano l aria attraverso i polmoni, si accoppiano e danno alla luce piccoli, già ad un elevato stadio di sviluppo, che allattano per molti mesi. Modellati dall evoluzione, per vivere e muoversi in ambiente acquatico hanno sviluppato una serie di modificazioni morfologiche, anatomiche e fisiologiche per adattarsi all elemento in cui vivono, infatti il loro aspetto ricorda quello dei pesci: la forma affusolata, la mancanza di un collo ed un torace che si assottiglia fino all estremità posteriore che termina con una poderosa coda disposta, però, orizzontalmente. La linea, variamente idrodinamica, è più accentuata in quelli che nuotano a maggiori velocità come i delfini e le balenottere, mentre è più tozza nelle balene che hanno movimenti più lenti. La pelle è sottile e solo apparentemente liscia, perché percorsa in realtà 8
da microsolchi, che dirigono il flusso dell acqua rendendo più veloce il nuoto. La caratteristica di questi mammiferi, ovviamente collegata all ambiente in cui vivono, è la quasi totale assenza di peli tranne alcune strutture con funzione tattile, atte ad avvertire la presenza di plancton, che si ritrovano sulla porzione anteriore del capo delle balene e delle balenottere. Il derma è ricco di recettori tattili particolarmente concentrati nelle zone maggiormente sensibili quali il capo, le pinne e in prossimità degli organi genitali. Il sottostante strato adiposo, spesso molto abbondante, limita la dispersione del calore, modella il corpo e bilancia il peso dell animale, consentendo il galleggiamento in quelle specie di Cetacei che hanno una densità media abbastanza vicina a quella dell acqua del mare. Invece, le specie che hanno densità leggermente superiore sono costrette a nuotare per galleggiare e, quindi, affondano quando muoiono. Altre, come il capodoglio che hanno densità inferiore, sono invece in grado di rimanere a galla anche immobili. Il capo, frequentemente molto sviluppato, termina con un rostro sempre presente a livello scheletrico ma evidenziabile esternamente soltanto nei delfini sotto la forma di un becco. Gli arti inferiori si sono trasformati in pinne pettorali di dimensioni molto ridotte rispetto alla mole del corpo e con funzione tipicamente direzionale; in molte specie compare la pinna dorsale, non sorretta da ossa, con funzione stabilizzatrice, la cui forma e posizione sono variabili e che è un elemento distintivo per il riconoscimento. La pinna caudale è piatta e rappresenta il principale organo di propulsione, grazie ad essa i Cetacei sono in grado di immergersi anche a grandi profondità, possono compiere spettacolari tuffi e nuotare velocemente in senso verticale. Le differenze fra le varie specie sono soprattutto a livello della pinna dorsale che può essere o presente in dimensioni variabili o del tutto assente, del rostro più o meno appuntito e lungo o completamente smussato, e dell apparato boccale che può essere provvisto di fanoni (Sottordine Misticeti) o di denti (Sottordine Odontoceti). La vita nell'ambiente acquatico, oltre a conferire a questi animali dimensioni talvolta colossali, ha profondamente modificato anche la struttura degli apparati interni. Infatti lo scheletro dei Cetacei, che non deve sostenere il corpo, è formato da ossa spugnose e impregnate di grasso, per migliorare il bilanciamento idrostatico. La colonna vertebrale ha un andamento rettilineo, la parziale mobilità della colonna vertebrale è favorita dalla presenza di dischi di natura cartilaginea che consentono un discreto movimento soprattutto della zona lombare; gli Odontoceti e i Misticeti si distinguono anche per la diversa conformazione del cranio; nei primi le ossa mascellari e premascellari si allungano anteriormente e si espandono posteriormente; sono fortemente asimmetriche per lo sviluppo di un particolare organo adiposo, detto melone, specializzato nella ricezione dei suoni, nei Misticeti, invece, l allungamento delle ossa mascellari e premascellari è solo anteriore ed è collegato allo sviluppo dei fanoni. Gli Odontoceti sono predatori e si alimentano 9
prevalentemente di organismi marini a crescita veloce come pesci, gamberi e molluschi cefalopodi; l orca è l unico rappresentante del sottordine capace di attaccare altri mammiferi marini. La forma e il numero dei denti variano in relazione alle specializzazioni alimentari. I Delfinidi hanno mascelle corte con numerosi denti conici in grado di offendere ogni tipo di preda; i Focenidi sono provvisti di mascelle allungate e di denti la cui estremità appiattita è adatta alla cattura di pesci e di invertebrati; altre specie quali il capodoglio e il grampo hanno denti solo sulla mascella inferiore, mentre possono mancare completamente come nello zifio. Il capodoglio, che si nutre e ingoia prede intere, possiede anche delle pieghe sottogolari che, espandendosi, facilitano l ingestione. I Misticeti hanno sostituito i denti con strutture filtranti detti fanoni. Sono delle lamine cornee inserite sulla mascella superiore e provviste di un ampio bordo sfrangiato che, rivolto verso la cavità orale, costituisce l'elemento filtrante. Il numero e la forma dei fanoni variano in relazione alle specie. Nelle balene, che si cibano nuotando lentamente con la bocca aperta, sono confinati nella parte posteriore della mascella e possono raggiungere anche i 5 metri di lunghezza. Nelle balenottere, che nuotano velocemente e si alimentano raccogliendo acqua e cibo in enormi quantità, i fanoni sono più numerosi e più corti; la stessa balenottera azzurra (Balaenoptera musculus) ha fanoni che non superano il metro di lunghezza. In un giorno una balenottera azzurra può mangiare anche tre tonnellate di crostacei. Naturalmente anche gli apparati circolatorio e respiratorio sono particolarmente adattati alle grandi profondità e alle lunghe apnee. Il ricambio d'aria nei polmoni, a differenza dei mammiferi terrestri, avviene in tempi molto brevi, con rapidissime inspirazioni ed espirazioni, intervallate da lunghi periodi di apnea. La frequenza respiratoria è molto bassa, infatti contrariamente a quanto si possa pensare, per non avere scompensi pressori interni, durante le immersioni i cetacei non immagazzinano grandi quantità di ossigeno nei polmoni, ma grazie alla presenza di un'elevata concentrazione di pigmenti respiratori (emoglobina nel sangue e mioglobina nei muscoli) sono infatti in grado di fissare nei tessuti circa il 90% dell'ossigeno inspirato. Oltre i 70 metri di profondità, infatti, sotto la sollecitazione della pressione idrostatica, i polmoni e la cassa toracica risultano compressi, provocando un collasso alveolare che interrompe lo scambio di gas respiratori tra polmoni e sangue. Il battito cardiaco risulta rallentato e alcuni distretti circolatori vengono isolati attraverso meccanismi selettivi di vasocostrizione, permettendo durante l immersione, una più efficace irrorazione degli organi importanti come il cervello. Infine, hanno un complesso sistema circolatorio di tipo arterioso presente soprattutto a livello delle pinne pettorali, dorsale e caudale, ed alla base del cranio. Ha una funzione di tipo termoregolatorio (attraverso un meccanismo di scambio di calore controcorrente ) e di risposta all immersione (cattura le bolle di azoto eventualmente generate in seguito alle alte pressioni raggiunte dall animale). 10
Anche l apparato escretore è un evidente segno del loro perfetto adattamento all ambiente marino. La quantità di urina è particolarmente abbondante ed ipertonica (concentrata) rispetto al mezzo esterno: ciò consente a questi mammiferi di ricavare direttamente dall'ambiente l'acqua necessaria al loro metabolismo, eliminando l'eccesso di sali. Riassumendo, i due grandi Sottordini possono cosi essere separati: I Misticeti (provvisto di fanoni) includono le balene vere: la balena della Groenlandia, le balene franche boreale (Eubalaena glacialis) e australe (Eubalaena australis) e la piccola caperea (Caperea marginata) o balena pigmea (circa 5 m); le balenottere (più snelle e veloci e con i solchi golari): azzurra, comune (Balaenoptera physalus), boreale, di Bryde (Balaenoptera edeni), minore (Balaenoptera acuto rostrata) e la megattera (Megaptera novaeangliae); oltre alla balena grigia (Eschrichtius Robustus) che forma un gruppo a sé. I Misticeti si distinguono per il particolare sistema di filtrazione del cibo, costituito dai "fanoni", che sono larghe lamine di una sostanza dura e flessibile (cheratina), radicate nella mascella superiore dell animale. Un altra caratteristica peculiare dei Misticeti è la presenza di uno sfiatatoio che si apre in posizione mediana nella parte superiore del capo con due orifizi, si riproducono nelle acque tropicali e subtropicali dell emisfero settentrionale e migrano verso sud per alimentarsi di krill durante l estate antartica. Dopo 3-4 mesi di alimentazione intensiva tornano nelle acque temperate. Gli Odontoceti (provvisti di denti) sono un gruppo abbastanza eterogeneo riuniti tassonomicamente in 9 famiglie. A differenza dei Misticeti possiedono un unico sfiatatoio sulla sommità della testa, le narici non sono fuse e una di loro è diventata dominante sull'altra. Come adattamento per l'ecolocalizzazione, il cranio è diventato asimmetrico, possiedono dei cervelli relativamente grandi, ma presenta poche connessioni tra i due emisferi. Sul loro capo si trova un organo chiamato melone che ha il compito di concentrare le onde sonore, agendo come una lente acustica. Le corde vocali sono assenti e i suoni vengono emessi mediante delle sacche aeree presenti sotto lo sfiatatoio. I denti differiscono considerevolmente tra le specie. Possono essere numerosi, (in alcuni delfini superano il centinaio), assumere forme bizzarre come nel narvalo, che possiede una singola lunga zanna o essere quasi totalmente assenti come negli zifidi, che presentano un solo dente nella mascella inferiore dei maschi. 11
3.2 Specie di interesse In questa tesi sono state prese in considerazione 7 specie di Cetacei (5 Odontoceti e 2 Misticeti) qui di seguito descritte : STENELLA STRIATA (Stenella coeruleoalba) Regno: Animalia Phylum: Chordata Classe: Mammalia (Linnaeus, 1758) Ordine: Cetacea (Brisson, 1762) Sottordine: Odontoceti (Flower, 1867) Famiglia: Delphinidae Genere: Stenella Specie: Stenella coeruleoalba (Meyen, 1833) Figura 1: Stenella coeruleoalba Categoria Red List & Criteria: Least Concern cioè a basso rischio di estinzione, in quanto la popolazione stimata è numerosa (oltre 2 milioni di esemplari in tutto il mondo) e non vi sono prove di un declino importante a livello mondiale che permetta di inserirla in una categoria di rischio (www.iucnredlist.org). 12