Fisiologia: studio della natura (Fysis, natura e Lógos, discorso ) STUDIO DEL NORMALE FUNZIONAMENTO DI UN ORGANISMO VIVENTE E DELLE PARTI CHE LO COMPONGONO Studio delle funzioni vitali del corpo umano..di tutti gli animali e piante Anatomia (Struttura) e Fisiologia (Funzione) sono strettamente correlate I campi di studio della Fisiologia Funzioni - Approccio Teleologico (télos, fine e lógos, discorso ) Processi - Approccio Meccanicistico sovrapposizioni
Omeostasi La tendenza degli organismi viventi a mantenere in uno stato di equilibrio le proprie caratteristiche al variare delle condizioni esterne. Termine coniato nel 1929 dal fisiologo americano Walter B. Cannon. Homeo- ( simile) stasis (nel senso di condizione). Parametri soggetti a controllo omeostatico Fattori Ambientali (osmolarità, Temperatura ph) Materiali per le necessità cellulari (nutrienti, acqua, sodio, calcio,altri ioni inorganici, ossigeno) Secrezioni interne (es ormoni)
Parte I - Fondamenti di Biologia cellulare e Biofisica della cellula Dinamiche di membrana. Struttura della membrana plasmatica. Il modello a mosaico fluido. Le proteine, i lipidi e i carboidrati della membrana. Proteoliposomi. Tecniche per lo studio delle proteine di membrana. Il trasporto di membrana di piccole molecole. Equazione generale dei trasporti. Forze agenti: potenziale chimico ed elettrochimico. Trasporti passivi: la diffusione. Trasporto mediato dalle proteine di membrana. Trasporti attivi primari e secondari. Trasportatori ABC e farmaco resistenza. Trasporti mediati da vescicole. Parte II - Elettrofisiologia Potenziale elettrochimico. Potenziale di diffusione. Potenziale di membrana a riposo. Parte III - Comunicazione Cellulare e Trasduzione Dei Segnali Cellulari Segnali elettrici. Eccitabilità. Potenziale d'azione. Basi ioniche dell eccitabilità di membrana. Proprietà molecolari e funzionali dei canali ionici voltaggiodipendenti. Eccitabilità della fibra nervosa, muscolare scheletrica e cardiaca. Propagazione dell impulso. Segnali chimici. Trasmissione sinaptica. Sinapsi elettriche. Sinapsi chimiche: struttura, funzionamento e regolazione. Inibizione presinaptica. Integrazione sinaptica. Il calcio e il rilascio di neurotrasmettitori. Neurotrasmettitori: classificazione, natura chimica e farmacologia. Modulazione dell attività sinaptica. Farmaci e droghe per lo studio delle sinapsi. La tecnologia del DNA ricombinante per lo studio di alcune sinapsi. Accoppiamento elettro-meccanico: la contrazione del muscolo scheletrico e cardiaco. Scossa muscolare. Unità motoria. Controllo della contrazione. Trasduzione del Segnale. Recettori di membrana, secondi messaggeri, Ormoni, Fattori di crescita. Meccanismi d azione ed applicazioni biotecnologiche. Parte IV - Distribuzione dell'acqua e dei soluti nell'organismo: equilibrio elettrico, chimico ed osmotico, osmosi e osmolarità. Sistemi tampone del sangue e della cellula. Parte V - Il sistema immunitario Risposte anticorpali e risposte mediate da cellule. TESTI CONSIGLIATI Facoltà di Scienze Biotecnologiche Corso di Laurea in Biotecnologie per l Innovazione di Processi e Prodotti Programma del corso di Fisiologia ed elementi di Biofisica (7+1) Docente: Dott. Grazia Paola Nicchia SILVERTHORN Fisiologia Umana ED. AMBROSIANA M. BERNE, M. LEVY Fisiologia ED. ABROSIANA B. ALBERTS "Biologia Molecolare della cellula" ED. ZANICHELLI H. LODISH: Biologia Molecolare della cellula ED. ZANICHELLI
Compartimenti liquidi funzionali del corpo
Le membrane del corpo Sottile strato di tessuto che riveste una cavità o separa due compartimenti Invenzione dei microscopi nel XVI secolo
LA MEMBRANA PLASMATICA
Funzioni di una membrana cellulare (membrana plasmatica o plasmalemma) Funzione contenitiva (Isolamento fisico) Funzione di scambio (Regolazione degli scambi con l ambiente) Funzione di riconoscimento (comunicazione tra cellula e ambiente) Supporto strutturale
Struttura delle membrane Film molto sottile di molecole lipidiche e proteiche tenute insieme da interazioni non covalenti Figura 3.4 Le membrane cellulari sono strutture dinamiche e fluide (Modello a mosaico fluido, Singer e Nicolson 1972) Le molecole lipidiche sono disposte come un doppiostrato dello spessore di circa 5-8 nm Il doppio strato lipidico forma la struttura base della membrana e funge da barriera selettiva
I LIPIDI DELLA MEMBRANA PLASMATICA I lipidi costituiscono circa il 50% della massa delle membrane FOSFOLIPIDI, COLESTEROLO e GLICOLIPIDI
I principali lipidi della membrana sono i FOSFOLIPIDI (fosfogliceridi e sfingolipidi) Colina I FOSFOGLICERIDI derivano da Glicerolo Gli SFINGOLIPIDI derivano da Serina Abbiamo anche il Fosfatidil Inositolo coinvolto nella trasduzione del segnale Variano in dimensioni, forma e carica
I principali lipidi della membrana sono i FOSFOLIPIDI o (fosfogliceridi) Sono molecole anfipatiche e insature (legami cis) Testa polare e due code idrocarburiche idrofobiche (14-24 atomi di C) Possono avere uno o piu legami cis (sature o insature). Questo e la lunghezza degli acidi grassi influenza la compatezza e quindi la fluidità FOSFATIDILCOLINA
Comportamento dei fosfolipidi in soluzioni acquose Le MICELLE sono importanti nei meccanismi di digestione e assorbimento dei grassi nel TGI I LIPOSOMI possono contenere molecole idrosolubili al loro interno. Oggi sono usati per il trasporto di farmaci attraverso la cute.
La forma e la natura delle molecole lipidiche determinano il loro comportamento in soluzione acquosa
Proprietà di autoriparazione Fornita dalle stesse forze che spingono i fosfolipidi a formare doppi strati Caratteristica fondamentale per per la creazione di una cellula vivente
Diffusione dei lipidi nel doppio strato (1970) Preparazioni utili a questi studi I liposomi Le membrane nere Si sono utilizzati lipidi marcati
Diffusione dei lipidi nel doppio strato I lipidi non migrano da uno strato all altro. Questo processo (flip-flop) avviene solo durante il processo di sintesi dei lipidi nel reticolo endoplasmatico. I movimenti dei fosfolipidi all interno della membrana sono: - diffusione laterale - rotazione attorno al loro asse maggiore - flessione
La fluidità del doppio strato lipidico La fluidità di un doppio strato lipidico dipende: 1) dalla temperatura 2) dalla sua composizione 1) La membrana resta fluida a temperature più basse. 2) Più le catene lipidiche sono corte o hanno doppi legami e più le membrane sono fluide.
IL COLESTEROLO Componente essenziale del doppio strato. Puo costituire fino al 50 % dei lipidi di membrana. Serve a stabilizzare la membrana in condizioni di temperatura corporea normale Il colesterolo rende i doppi strati lipidici meno fluidi in quanto rende il doppio strato meno deformabile in quelle regioni in cui esso interagisce con altri fosfolipidi. Fa così diminuire la permeabilità del doppio strato a piccole molecole solubili in acqua
I GLICOLIPIDI Rappresentano il 5% dei lipidi del monostrato esterno Si trovano nella metà non citoplasmatica del doppi strato lipidico (distribuzione asimmetrica) Funzioni Nella membrana apicale degli epiteli possono avere funzione protettiva (es. enzimi e ph). I glicolipidi nelle cell animali derivano da serina Glicolipidi carichi possono essere importanti per i loro effetti elettrici. Importanti nei processi di riconoscimento (Ganglioside G M 1, recettore di superficie per la tossina colerica presente nelle cellule epiteliali dell intestino). I glicolipidi piu complessi, i GANGLIOSIDI (circa una quarantina), contengono oligosaccaridi con uno o piu residui di acido sialico che conferisce carica netta negativa. Nelle cell nervose rappresentano circa il 5-10 % dei lipidi. (NANA= acido N-Acetil NeuroAminico) Glicolipide Neutro
I lipid raft o zattere lipidiche Piccole Aree Specializzate della Membrana (di circa 70 nm di diametri) in cui sono concentrati Sfingolipidi, Colesterolo e Proteine Gli sfingolipidi avendo catene idrocarburiche lunghe creano delle forze attrattive maggiori favorendo la formazione di microdomini. I lipid raft aiutano a concentrare proteine (es per facilitare il trasporto in piccole vescicole, o facilitando la trasmissione del segnale) Nei lipid raft i due monostrati sono comunicanti tra loro
Asimmetria del doppio strato lipidico (Membrana Plasmatica di globulo rosso) EXT: Fosfatidilcolina e Sfingomielina Il colesterolo si pensa sia distribuito in modo uguale nei monostrati INT: Fosfatidiletanolamina e Fosfatidilserina L asimmetria dei lipidi è funzionalmente importante: ex PKC richiede PS per la sua attività
Alcune funzioni dei fosfolipidi di membrana PI = fosfatidilinositolo : fosfolipide minore coinvolto nella trasmissione del segnale Legami fosfoesteri Legami esteri Fosfolipasi: Enzimi che tagliano i fosfolipidi
LE PROTEINE DELLA MEMBRANA PLASMATICA
Le proteine di membrana Composizione chimica di alcune membrane (in % ) Membrana Proteine Mielina 18 Eritrocita 49 Epatocita 44 Mitocondrialeinterna 76 Lipidi 79 43 52 24 Carboidrati 3 8 4 0 La quantità e i tipi di proteine in una membrana sono altamente variabili Da un punto di vista anatomico si dividono in PROTEINE INTEGRALI PROTEINE PERIFERICHE PROTEINE ANCORATE AI LIPIDI
Le proteine di membrana Proteine Integrali di Membrana (Transmembrana) Proteine Periferiche di Membrana Natura Anfipatica Possono avere da 1 a 12 segmenti Oligosaccaride legato al fosfatidilinositolo Ancora di GPI (glicosilfosfatidilinositolo) Rilasciate dalla fosfolipasi C Alfa-elica anfipatica Il legame covalente con un lipide ne aumenta l anfipaticità Lipide con legame covalente. Prodotte come proteine solubili nel citosol Interazioni non covalenti L organizzazione strutturale riflette la funzione
Proteine Integrali di Membrana - Struttura α-elica
Struttura α-elica delle proteine di membrana Le proteine transmembrana nella maggior parte attraversano la membrana in conformazione α-elica). Poiché i legami peptidici sono polari e poiché l acqua è assente nel doppio strato, essi formano tra loro legami idrogeno favoriti da tale conformazione. I legami idrogeno tra i legami peptidici stabilizza la catena. L α-elica rappresenta il ripiegamento piu naturale che una catena polipeptidica possa assumere. Prozione Polipeptidica del Centro di reazione fotosintetico
Grafici di Idropatia Difficili da cristallizzare e pertanto difficili da studiare per cristallografia ai raggi X Grafici di idropatia misura della polarità di un residuo aminoacidico. Per localizzare potenziali segmenti ad α-elica di una catena polipeptidica Indice di idropatia: l energia necessaria per trasferire segmenti successivi di una catena polipeptidica da un solvente NON polare all acqua. Il calcolo viene fatto per segmenti di 10-20 aa. Valori positivi: è richiesta energia per il trasferimento all acqua segmento idrofobico.
La Glicoforina A - tipica proteina transmembrana ad attraversamento singolo Piccola glicoproteina (30kDa) dei globuli rossi. Presente in forma dimerica. Abbondante (10 6 copie per cellula). La parte N-terminale è glicosilata. Funzione sconosciuta.
La Batteriorodopsina - proteina transmembrana ad attraversamento multiplo Pompa protonica attivata dalla luce sette α-eliche. Trasduttore di energia solare in energia utile alla cellula Archeo Halobacterium Salinarum. Batteri fotosintetici Chiazze di membrana purpurea contenenti molecole di batteriorodopsina Il cromoforo in grado di assorbire fotoni luminosi. In seguito al legame con un singolo fotone si eccita, determina un cambiamento conformazionale della proteina che trasporta H + al di fuori della cellula. Ciò crea un gradiente di protoni a cavallo della membrana plasmatica che fornisce energia alla cellula. E identico al cromoforo nella rodopsina delle cellule fotorecettrici dell occhio dei vertebrati.
Proteine Integrali di Membrana - Struttura a barili-β
Struttura a barili-β Modo alternativo per i legami peptidici nel doppio strato lipidico di soddisfare le loro richieste di formare legami idrogeno. Formano strutture molto rigide e meno flessibili delle α-eliche e per questo sono abbondanti nella membrana esterna dei mitocondri, dei batteri e e dei cloroplasti ma poco nelle cellule eucariotiche. Perché sono difficili i cambiamenti conformazionali. Alcuni barili-β formano dei grossi canali transmembrana (le Porine) Sito di legame per il Ferro Recettore per un virus batterico Lipasi Porina batterica Proteina trasp ioni Ferro
Le Porine Sono proteine transmembrana che formano pori e attraversano il doppio strato lipidico come un barile β Si trovano sulla membrana esterna dei batteri e permettono ai soluti idrofilici fino a 600 Da di diffondere attraverso il doppio strato esterno - Il canale all interno è rivestito da catene aa polari. Anse che sporgono nel lume hanno la funzione di restringerlo in modo da renderlo selettivo solo per alcuni soluti Ciascun monomero consiste di un barile β composto da 16 filamenti antiparalleli. Tutte le porine sono proteine transmembrana trimerichei grafici di idropatia non possono identificare i segmenti che attraversano la membrana come β-barili perché di solito meno di 10 aa sono sufficienti ad attraversare il doppio strato lipidico. Tuttavia si fanno cristallizzare facilmente (struttura raggi X)
Proteine Periferiche - Ancoraggio mediante gruppi idrocarburici legati covalentemente L attacco covalente tramite diversi tipi di lipidi serve alla localizzazione di una proteina nella membrana dopo la sua sintesi nel citosol Molte proteine sono ancorate agli sfingolipidi dei lipid raft
Attacco delle proteine alla membrana tramite lipidi Carboidrati (numero variabile) ANCORE GPI (Glicosil Fosfatidil Inositolo) Molti proteoglicani ANCORE ACILICHE Es: v-src (forma mutante di TK ) ANCORE PRENILICHE Es: prot Ras e Rab (famiglia di GTPasi) Gruppo acilico: miristato (C14) o palmitato (C16) Gruppo prenilico: farnesile (C15) o geranilgeranile (C20)
Ancoraggio di proteine periferiche attraverso proteine integrali di membrana NOTE: La glicosilazione è presente sempre sul lato non citoplasmatico della membrana. L ambiente citoplasmatico riducente non consente la formazione di legami disolfuro. I legami disolfuro dal lato extracellulare hanno un ruolo importante nello stabilizzare la struttura ripiegata della catena o la sua associazione con altre catene polipeptidiche
Il Glicocalice La superficie della cellula è ricoperta di zuccheri che si trovano - come catene oligosaccaridiche legate covalentemente alle proteine e ai lipidi di membrana - come proteoglicani (lunghe catene polisaccaridiche unite covalentemente ad un nucleo proteico). Ruolo del glicocalice : Rivestimento Cellulare di un Linfocita colorato con Rosso Rutenio 1 - protezione contro il danneggiamento meccanico e chimico 2 - mediare processi temporanei di adesione cellula-cellula Il glicocalice si visualizza con vari coloranti come il ROSSO RUTENIO o con LECTINE marcate. Le lectine sono proteine affini ai carboidrati Schema semplificato del glicocalice
Studio delle Proteine di Membrana Approcci sperimentali
La membrana plasmatica dei globuli rossi Vantaggi Grande disponibiltà Non hanno nucleo o organelli (non c è contaminazione da altri tipi di membrane) Membrana facile da preparare: I fantasmi dei globuli rossi:
Proteine della membrana plasmatica dei globuli rossi Spettrina, glicoforina e banda 3 costituiscono più del 60% in peso delle proteine totali di membrana dei globuli rossi.
Purificazione delle proteine Purificazione delle proteine globulari idrosolubili Quando sono separate dalle membrane queste proteine mantengono la loro conformazione nativa in un mezzo acquoso poiché presentano molti gruppi idrofilici esposti Purificazione delle proteine di membrana Quando sono separate dalle membrane le regioni idrofobiche di queste proteine interagiscono causandone l aggregazione in un mezzo acquoso. Necessitano di essere solubilizzate nei DETERGENTI
I detergenti Purificazione delle proteine di membrana I DETERGENTI Non ionici Le moleclole di detergente sono anfipatiche e tendono a formare micelle in acqua Ionici Idrofobica Idrofilica CMC: Concentrazione micellare critica. La CMC alla quale si formano le micelle è una caratteristica di ogni detergente dipendente dalla sua struttura
Agiscono in modi differenti a seconda delle diverse concentrazioni Si legano alle regioni idrofobiche esposte delle prot di membrana e al nucleo idrofobico delle proteine idrosolubili. A causa della carica questi detergenti distruggono anche i legami ionici e i legami idrogeno. Denaturano le proteine
Solubilizzazione di proteine integrali di membrana con detergenti NON ionici
Purificazione e ricostituzione della pompa Na + -K + Occorre utilizzare detergenti blandi!!
ELETTROFORESI SDS PAGE e Western Blot (Immunoblotting) SDS - PAGE Western Blot (Immunoblotting)
Consente di studiare la morfologia della membrana, la localizzazione e la disposizione delle proteine di membrana Microscopia elettronica di crio-frattura Freeze Fracture Electron Microscopy (FFEM) Le cellule sono congelate in azoto liquido e il blocco congelato viene fratturato con un coltello
Microscopia elettronica di crio-frattura Freeze Fracture Electron Microscopy (FFEM)
FFEM - Banda 3 e Glicoforina La proteina tende a rimanere con il monostrato che contiene la massa principale della proteina Le molecole di banda 3 restano in genere con la faccia P di frattura Le molecole di glicoforina rimangono in genere con la faccia esterna (E) di frattura
- FFEM - Visualizzazione di aggregati della proteina canale per l acqua Acquaporina-4 (AQP4) E P
Diffusione delle proteine Le proteine di membrana non passano attraverso il doppio strato (flipflop) ma possono ruotare (diffusione rotazionale) o muoversi lateralmente nella membrana (diffusione laterale) o flettersi (flessione).
Esperimento che dimostra che le proteine di membrana diffondono lateralmente
TECNICHE DI FOTOSBIANCAMENTO MISURAZIONE DELLA VELOCITA DI DIFFUSIONE LATERALE DI UNA PROTEINA DI MEMBRANA La proteina di interesse deve essere marcata con un anticorpo fluorescente o essere espressa come proteina di fusione con una proteina fluorescente (es. GFP). Si ricava il coefficiente di diffusione laterale della proteina che puo variare a seconda del tipo cellulare in cui la proteina è espressa FRAP FLIP FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching): recupero della fluorescenza dopo fotosbiancamento FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching: perdita di fluorescenza nel fotosbiancamento
- FRAP - Velocità di diffusione laterale della proteina canale per l acqua Acquaporina-4 (AQP4)
Le cellule possono confinare proteine e lipidi in domini specifici della membrana TIGHT JUNCTIONS NELLE CELLULE EPITELIALI Nelle cellule epiteliali questa distribuzione asimmetrica è spesso essenziale per la funzione dell epitelio stesso
Tre domini diversi nella stessa cellula spermatica In questo caso esistono domini diversi senza la presenza di tight junctions.
Quattro modi in cui la diffusione laterale delle proteine di membrana può essere ristretta Le proteine si autoassemblano in grossi aggregati Membrana purpurea dell halobacterium Le proteine possono essere legate da interazioni con complessi di macromolecole all esterno (B) o all interno (C) della cellula Le proteine possono interagire con proteine sulla superficie di un altra cellula