MONITORAGGIO DELLA MUTAGENICITÀ DEL PARTICOLATO ATMOSFERICO URBANO: RETE REGIONALE DELL EMILIA-ROMAGNA AGGIORNAMENTO ANNO 2004

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1 SEZIONE PROVINCIALE DI PARMA Via Spalato, sez@pr.arpa.emr.it Eccellenza Mutagenesi Ambientale MONITORAGGIO DELLA MUTAGENICITÀ DEL PARTICOLATO ATMOSFERICO URBANO: RETE REGIONALE DELL EMILIA-ROMAGNA AGGIORNAMENTO ANNO 24 A cura di: Dr.ssa Francesca Cassoni Responsabile Eccellenza Mutagenesi Ambientale Dr.ssa Clara Bocchi Eccellenza Mutagenesi Ambientale Prot. Arpa 1385/5 25 Luglio 25

2 Si ringrazia per la collaborazione nella redazione e per il supporto tecnicoscientifico: Dr.ssa Anna Martino Dipartimento di Genetica Antropologia Evoluzione, Università degli Studi di Network Team Arpa Emilia-Romagna PM 2,5 e PM 1 Dr. Gallinari G, Dr.ssa Bernardi D, Lodigiani A, Bottazzi M (Piacenza); Dr.ssa Cassoni F, Dr.ssa Bocchi C, Fontana F, Pinto G (); Dr.ssa Guerra L, Dr.ssa Natali P, Dr. Boraldi V, (Modena); Dr.ssa Casali AM (Bologna); Dr.ssa Canossa E (Ferrara); Dr.ssa Lombardi F, Dr.ssa Nizzoli C, Dr.ssa Bacchi M, (Forlì-Cesena); Dr.ssa Lucialli P, Dr.ssa Pagnani M, Dr. Bandini F, (Ravenna); Dr.ssa Anelli P, Dr. Zamagni M (ARPA-Rimini). Collaborazioni: Eccellenza Microinquinanti organici, Arpa Emilia-Romagna, Sezione Provinciale di Ravenna: Dr. Ivan Scaroni Analisi in gas-massa degli IPA.

3 INTRODUZIONE 1 Siti e periodi di campionamento del particolato atmosferico... 2 MATERIALI E METODI... 3 RISULTATI PM 2, PM CONCLUSIONI... 26

4 INTRODUZIONE L attività della rete regionale di monitoraggio della mutagenicità del particolato atmosferico (Particulate Matter - PM) in ambiente urbano, gestita da Arpa Emilia-Romagna, è proseguita, nell anno 24, con alcune modifiche, infatti i test di mutagenesi sono stati effettuati sul particolato atmosferico campionato nei mesi ritenuti più significativi nell ambito di ogni stagione, valutati in base alla serie storica dei dati e più precisamente: Gennaio e Febbraio come mesi rappresentativi dell inverno; Aprile come mese rappresentativo della primavera; Luglio come mese rappresentativo dell estate; Novembre e Dicembre come mesi rappresentativi dell autunno. Per poter confrontare i dati del 24, con quelli dei periodi precedenti, in questo report sono presentati i dati relativi al periodo Gennaio 21/Dicembre 24, considerando solo i sei mesi monitorati nell ultimo anno. Nell anno 24 per ampliare la conoscenza dell effetto genotossico globale del PM, oltre alla ricerca di sostanze in grado di indurre mutazioni puntiformi, eseguita con test su Salmonella, su alcuni campioni è stato effettuato il test dei Micronuclei (MN) su linfociti umani coltivati in vitro. Questo test è in grado di rilevare la presenza di sostanze che inducono rotture (sostanze clastogene) e/o che causano la perdita di interi cromosomi (sostanze aneuploidogene); è stata inoltre verificata l eventuale relazione dei micronuclei con alcune classi di contaminanti fisico-chimici. Pag. 1 di 29

5 Siti e periodi di campionamento del particolato atmosferico In tabella 1 si riportano i siti e l inizio dell attività delle stazioni di prelievo delle frazioni PM 2,5 e PM 1 della rete regionale. Tabella 1. Città e data di inizio monitoraggio Piacenza da settembre 2 da settembre 1998 Modena da settembre 2 Bologna Lug -Dic- 1, da Ott 2 Ferrara Da marzo 23 (con discontinuità) Forli da novembre 2 (con discontinuità) Cesena da novembre 2 (con discontinuità) Rimini da agosto 2 Città e data di inizio monitoraggio da settembre 1998 Ravenna da settembre 2 PM2,5 Sito di Campionamento Tipologia sito Campionatore N di residenti/comune Via Piatti (UTMX: ; UTMY: ) Via Spalato 2 (UTMX: 642; UTMY: ) fino a ott.3; da nov. 3, V.le Vittoria (UTMX: 63955; UTMY: ) Via Cimone, quartiere Terranova (UTMX: ; UTMY: ) Zona Malpighi (UTMX: ; UTMY: ) Corso Isonzo Viale Cavour UTMX: 75514; UTMY:967725) V.le Salinatore 2 (UTMX: ; UTMY: 49964) Via Rio Marano 38 (UTMX: ; UTMY: ) Via Abete (UTMX: 3449; UTMY: 48823) media intensità di traffico veicolare e alta densità abitativa. Via Spalato: media intensità di traffico veicolare e alta densità abitativa; Viale Vittoria: alta intensità di traffico veicolare. media intensità di traffico veicolare e alta densità abitativa media intensità di traffico veicolare e alta densità abitativa. media intensità di traffico veicolare e alta densità abitativa. elevata intensità di traffico veicolare elevata intensità di traffico veicolare media intensità di traffico veicolare e alta densità abitativa. PM1 Giornaliero (TECORA) Giornaliero (TECORA) Sequenziale RANCON mod. PARTISOL PLUS Giornaliero (TECORA) Sequenziale (TECORA) Giornaliero (TECORA) Giornaliero (TECORA) 9948 Giornaliero (TECORA) Sito di Campionamento Tipologia sito Campionatore N di abitanti/comune Come per PM 2,5 Come per PM 2,5 Giornaliero (TECORA) Rocca Brancaleone (UTMX: ; UTMY: 92399) Parco cittadino In continuo Enviromental mod. MP11M Pag. 2 di 29

6 MATERIALI E METODI I campioni di particolato atmosferico sono stati prelevati ed estratti presso i singoli nodi della rete regionale, mentre i test di mutagenesi e l elaborazione dei dati sono stati eseguiti dall Eccellenza Mutagenesi ambientale (Sezione Provinciale di ) secondo le modalità precedentemente descritte (vedi Report relativo all attività della rete nel periodo ). Gli estratti dei campioni mensili di particolato atmosferico sono stati sottoposti a test di Ames utilizzando i ceppi TA98 e TA1 di Salmonella typhimurium in presenza e in assenza di attivazione metabolica esogena (S9). Sugli stessi estratti di particolato (PM 1 e PM 2,5 ) è stata rilevata la concentrazione di Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA), secondo le modalità precedentemente descritte (vedi Report relativo all attività della rete nel periodo ), presso la Sezione Provinciale di Ravenna, nell ambito delle attività dell Eccellenza Microinquinanti organici. Tale determinazione viene eseguite dal 21 per quanto riguarda il PM campionato a e Ravenna e dal 23 per quanto riguarda la rete di monitoraggio del PM 2,5. Gli IPA rilevati sono: naftalene, acenaftilene, acenaftene, fluorene, fenantrene, antracene,,, benzo(a)antracene, crisene, benzo(b), benzo(k), benzo(e), benzo(a), indeno(1,2,3-cd), dibenzo(a,h)antracene, benzo(ghi)perilene; dibenzo(a,e), dibenzo(a,i), dibenzo(a,h). Test dei micronuclei (MN) su linfociti umani coltivati in vitro Il metodo definito "cytokinesis-block micronucleus assay" (test CBMN) consiste nella coltivazione in vitro dei linfociti posti a contatto con sostanze potenzialmente mutagene. Il linfocita è un indicatore biologico ideale, infatti è facilmente reperibile, può essere tenuto in coltura per esposizioni in vitro ad agenti mutageni e si presta per la costruzione di curve dose/risposta. I micronuclei (MN), ritenuti indicatori indiretti di aberrazioni cromosomiche strutturali, sono piccoli corpi extranucleari, di dimensioni inferiori rispetto al nucleo, che si formano al termine di una divisione cellulare dalla perdita di frammenti o di cromosomi interi, originando così, nelle cellule in interfase, corpuscoli intracitoplasmatici liberi, di forma rotondeggiante o ovale, chiaramente distinti dal nucleo principale. La conta dei MN viene effettuata sulle cellule binucleate ottenute in seguito al trattamento con Citocalasina B, sostanza in grado di inibire la divisione cellulare senza impedire la duplicazione dei nuclei. Pag. 3 di 29

7 RISULTATI PM 2,5 Osservando l evoluzione temporale della mutagenicità del particolato atmosferico, espressa come fattore di genotossicità totale nei periodi indicati (Tab.1), si riscontrano, come già riportato nei report precedenti, una presenza costante di sostanze mutagene con valori più elevati nei periodi autunno-invernali e minimi nei periodi più caldi (Tab.2), senza un trend evidente. Tabella 2 Rete Regionale di Monitoraggio della Genotossicità del particolato atmosferico urbano, Arpa Emilia-Romagna. Mutagenicità del particolato atmosferico urbano (PM 2,5 ) rilevata come Fattore di Genotossicità su tutti i test in Salmonella typhimurium. Intervalli di positività Giudizio FG 1,4 negativo 1,5 FG 2,9 debolmente positivo 3, FG 14,9 positivo FG 15, fortemente positivo Piacenza Modena Bologna Ferrara Forlì Cesena Rimini Gen 1 49,2 9,3 23,2 22,1 nd 12,8 6,7 6,2 Feb1 24, ,6 35,3 nd 6,3 6,3 2,5 Apr1 1,7 3 2,1 1,8 nd 4,7 1,3,4 Lug ,8 3,4 nd 1,9 2,5 Nov1 26,6 27,6 22,1 19,9 nd nd nd 3,9 Dic1 78,5 37,7 35,3 2,4 nd 4,1 nd 4,3 Gen 2 43, ,4 nd nd 89,4 32,8 8,1 Feb2 35,8 32,8 15,2 nd nd 3,8 23,4 2,2 Apr2 3,4 5,9,6 nd nd 13,1 4,9,6 Lug2,8,3 1,2 nd nd 1,3 1,4,5 Nov2 25,4 8,9 33,5 17,2 nd 19,9 5,3 1,6 Dic2 12,4 19,6 21,7 16,6 nd 24,2 12,3 9,7 Gen3 35,5 21,7 16,8 nd nd 27,4 23,5 7,1 Feb3 25,9 24,7 41,9 16,4 nd 27,1 17,2 25,7 Apr3 4,8 3,5 4,6 2,2 1,4 4,5 2,4 1,7 Lug3 1,7,7,5,4,5 1,8 1,8,3 Nov3 18,3 6,8 19,5 2,7 13,2 18,6 19,2 34 Dic3 28,7 6,4 9 6,1 nd 34, ,9 Gen ,8 19,5 14,5 13,9 32,3 17,3 42,1 Feb4 16,5 12,2 16,4 16,7 2,8 14,5 nd 22,7 Apr4 4,3 2,4,3 1,8 1,9 1,9 4,6 4,5 Lug4 1,1,8,3,5,9,5,3,6 Nov4 21,5 19,6 17,8 18,7 27, ,6 nd Dic4 54,4 14,7 13,5 25,5 49,5 36,4 nd 14,6 Pag. 4 di 29

8 In Figura 1 si riportano le medie dei revertenti per Nm 3 di aria rilevati con i quattro test utilizzati, nei nodi della rete, calcolate per i periodi autunnali e invernali in quanto ritenuti più significativi per quanto riguarda la mutagenicità del particolato atmosferico. Figura 1. - Rete Regionale di Monitoraggio della Genotossicità del particolato atmosferico urbano, Arpa Emilia-Romagna. Mutagenicità del particolato atmosferico urbano (PM 2,5 ) rilevata come numero medio (medie stagionali: autunnali e invernali) di revertenti/nm 3 di aria, rilevata nei periodi e nei siti indicati Piacenza Modena Bologna Ferrara 6 3 nd inv '1 aut '1 inv '2 aut '2 inv '3 aut '3 inv '4 aut '4 inv '1 aut '1 inv '2 aut '2 inv '3 aut '3 inv '4 aut '4 inv '1 aut '1 inv '2 aut '2 inv '3 aut '3 inv '4 aut '4 inv '1 aut '1 inv '2 aut '2 inv '3 aut '3 inv '4 aut '4 aut '3 inv '4 aut '4 TA98 TA98+ TA1 TA1+ 12 Forlì Cesena Rim ini nd inv '1 aut '1 inv '2 aut '2 inv '3 aut '3 inv '4 aut '4 inv '1 aut '1 inv '2 aut '2 inv '3 aut '3 inv '4 aut '4 inv '1 aut '1 inv '2 aut '2 inv '3 aut '3 inv '4 aut '4 TA98 TA98+ TA1 TA1+ Valutando l aspetto qualitativo (es.: induzione di mutazioni per sostituzione piuttosto che per inserzione o delezione di basi, presenza di mutageni diretti o di promutageni) della mutagenicità del particolato, in tutti i nodi della rete, nell intero periodo, si osservano valori più elevati di revertenti per Nm 3 di aria in assenza di attivazione metabolica esogena per entrambi i ceppi di Salmonella (t di Student, p<,5), evidenziando nel PM una prevalenza di sostanze ad azione mutagena diretta. Tuttavia all interno della serie storica, è possibile Pag. 5 di 29

9 notare che, a Forlì e, vi è stato un cambiamento qualitativo della miscela complessa PM, infatti, fino agli ultimi mesi del 21 era prevalente la risposta del ceppo TA1 in presenza di attivazione metabolica, mentre nel periodo successivo si assiste ad una inversione di tendenza, dimostrando un cambiamento nel rapporto fra mutageni diretti e indiretti che inducono sostituzione di base. Dal punto di vista quantitativo (revertenti/nm 3 ) l attività mutagena del PM, all interno di ogni nodo, mostra continue variazioni negli anni, in assenza di un trend, sebbene nell autunno-inverno 3-4, rispetto all anno precedente, nelle città di Piacenza, e Bologna si sia osservata una diminuzione del carico mutageno (t di Student, p<,5). Rimini merita particolare attenzione in quanto ha sempre mostrato un andamento opposto rispetto ai restanti nodi regionali, mantenendosi a livelli di mutagenicità molto bassi fino all autunno 22, da quando si è osservato un aumento dell attività mutagena del PM fino ad arrivare, nell inverno scorso, a livelli comparabili o superiori ai restanti nodi. Confrontando i valori di mutagenicità fra i nodi della rete si riscontrano differenze quantitative, anche fra città con siti di campionamento simili per quanto riguarda l intensità del traffico veicolare e le concentrazioni dei tradizionali inquinanti chimici, come NO 2 e CO. Per una migliore caratterizzazione della mutagenicità, in ogni nodo della rete, sono state registrate le medie mensili di NO 2 e CO (Fig.2), infatti questi gas, pur non essendo una causa diretta della mutagenicità del particolato, sono, in generale, dei buoni indicatori di inquinamento antropico e per questo motivo, in alcuni casi, possono essere considerati buoni descrittori dell andamento della mutagenicità del particolato atmosferico per un determinato sito. Pag. 6 di 29

10 Figura 2. - Rete Regionale di Monitoraggio della Genotossicità del particolato atmosferico urbano (frazione PM 2,5 ), Arpa Emilia-Romagna. Evoluzione temporale delle concentrazioni (medie mensili) di NO 2 e di CO nei nodi della rete regionale (dati forniti dalla rete regionale di monitoraggio della qualità dell aria Arpa Emilia Romagna). µg/m 3 mg/nm Concentrazioni medie mensili di NO 2 gen-1 feb-1 apr-1 lug-1 nov-1 dic-1 gen-2 feb-2 apr-2 lug-2 nov-2 dic-2 gen-3 feb-3 apr-3 lug-3 nov-3 dic-3 gen-4 feb-4 apr-4 lug-4 nov-4 dic-4 Piacenza Modena Bologna Rimini Ravenna Forlì Cesena Ferrara 3, 2,5 2, 1,5 1,,5, gen-1 feb-1 Concentrazioni medie mensili di CO apr-1 lug-1 nov-1 dic-1 gen-2 feb-2 apr-2 lug-2 nov-2 dic-2 gen-3 feb-3 apr-3 lug-3 nov-3 dic-3 gen-4 feb-4 apr-4 lug-4 nov-4 dic-4 Piacenza Modena Bologna Rimini Ravenna Forlì Cesena Ferrara I coefficienti di correlazione (r) ottenuti confrontando il numero di revertenti/nm 3 con le concentrazioni di CO e NO 2 (Tab.4) differiscono notevolmente tra i nodi della rete, variando da valori di r di -,1 fino a r di,9, evidenziando, anche in questo caso, la molteplicità dei Pag. 7 di 29

11 fattori che intervengono nel determinare la mutagenicità del PM. Questo lo si può constatare anche dall osservazione che a parità di concentrazione di questi inquinanti si possono avere valori molto diversi di mutagenicità tra nodi sia in diversi periodi, che nello stesso periodo. Ad esempio alla stessa concentrazione di NO 2 di 62 µg/nm 3 sono stati rilevati, a nel gennaio 22, 23 revertenti/nm 3, mentre a Piacenza nel febbraio 24, 67 revertenti/nm 3 ; inoltre nel mese di dicembre 24 con una concentrazione di NO 2, pari a 56 µg/nm 3, a sono stati rilevati 6 revertenti/nm 3 e a Piacenza 181 revertenti/nm 3. Pag. 8 di 29

12 Tabella 4. Rete Regionale di Monitoraggio della Genotossicità del particolato atmosferico urbano (frazione PM 2,5 ), Arpa Emilia-Romagna. Coefficienti r ottenuti dalle correlazioni fra rev/nm 3 (PM 2,5 e PM 1 ) e concentrazione di CO e NO 2 da gennaio 21 a dicembre 24nelle città indicate. Bologna Piacenza Modena Rimini Ferrara (apr3- dic4) Forlì Cesena PM 2,5 rev/nm 3 (µg/nm 3 ) (mg/nm 3 ) NO 2 CO TA 98,6,7 TA 98 +,5,7 TA 1,5,7 TA1+,5,7 TA 98,7,4 TA 98 +,7,4 TA 1,7,5 TA1+,7,4 TA 98,7,9 TA 98 +,6,8 TA 1,7,8 TA1+,6,8 TA 98,6,5 TA 98 +,7,6 TA 1,5,4 TA1+,6,5 TA 98 -,1,1 TA 98 +,,2 TA 1 -,1 -,1 TA1+,2,4 TA 98,2,8 TA 98 +,2,7 TA 1,2,7 TA1+,2,7 TA 98,7,6 TA 98 +,6,6 TA 1,7,6 TA1+,7,6 TA 98,5,7 TA 98 +,5,7 TA 1,5,6 TA1+,5,7 Ravenna PM 1 rev/nm 3 NO 2 (µg/nm 3 ) CO (mg/nm 3 ) TA 98,6,7 TA 98 +,5,7 TA 1,6,7 TA1+,6,7 TA 98,4,6 TA 98 +,3,6 TA 1,4,7 TA1+,3,7 Pag. 9 di 29

13 Gli andamenti della mutagenicità del PM (sommatoria dei revertenti/nm 3 ) e della concentrazione delle medie mensili delle polveri (Tab.5, Fig.3,4), in generale, sono simili, anche se la correlazione tra questi parametri non è sempre evidente. Infatti, i valori dei coefficienti di determinazione (R 2 ) ottenuti dalle regressioni lineari tra concentrazioni di particolato (µg/nm 3 ) e numero totale di revertenti indotti per Nm 3 di aria, differiscono a seconda dei siti di campionamento (Tab.6). Considerando siti comparabili, per intensità di traffico veicolare e densità abitativa, si riscontra che non sempre a parità di concentrazione di PM 2,5 corrispondono livelli comparabili di mutagenicità (Fig.4). Questo conferma che la mutagenicità è determinata non solo dalla quantità del particolato atmosferico, ma, soprattutto, dalle sue caratteristiche chimiche. Figura 3. Rete Regionale di Monitoraggio della Genotossicità del particolato atmosferico urbano (frazione PM 2,5 ), Arpa Emilia-Romagna. Concentrazioni (medie mensili)di particolato atmosferico (PM 2,5 ) (µg/nm 3 ). PM2,5 Piacenza Modena Bologna Forlì Cesena Rimini Ferrara µg/nm gen-1 feb-1 apr-1 lug-1 nov-1 dic-1 gen-2 feb-2 apr-2 lug-2 nov-2 dic-2 gen-3 feb-3 apr-3 lug-3 nov-3 dic-3 gen-4 feb-4 apr-4 lug-4 nov-4 dic-4 Pag. 1 di 29

14 Tabella 5. Rete Regionale di Monitoraggio della Genotossicità del particolato atmosferico urbano (frazione PM 2,5 ), Arpa Emilia-Romagna. Concentrazioni (medie mensili)di particolato atmosferico (PM 2,5 ) (µg/nm 3 ). Piacenza Modena Bologna Ferrara Forlì Cesena Rimini Gen1 38,42 45,4 42,14 34,61 nd 31,43 26,47 nd Feb1 48,63 5,75 52,31 25,29 nd 32,39 2,86 nd Apr1 23,35 23,82 14,36 17,1 nd 15,42 14,84 nd Lug1 19,81 21,95 17,9 19,5 nd 25,27 24,9 nd Nov1 48,55 35,1 42,49 38,15 nd nd nd nd Dic1 88,59 5,48 54,96 45,15 nd 38, nd nd Gen1 71,64 67,11 48,73 nd nd 7,91 57,42 nd Feb2 58,78 39,63 44,37 nd nd 37,9 43,79 nd Apr2 3,9 48,84 23,85 nd nd 34,4 25,1 nd Lug2 19,31 2, 22,59 nd nd 35,59 21,18 11,79 Nov2 51,23 5,63 49,39 33,84 nd 23,42 19,36 19,35 Dic2 25,7 45,75 34,97 32,65 nd 23,46 32,32 25,85 Gen 3 69,16 59,6 48,44 nd nd 54,97 52,57 36,61 Feb3 49,23 54,26 46,88 49,29 nd 7,93 31,67 38,14 Apr3 19,8 37,6 38,88 24,5 18,79 27,44 32,98 2,75 Lug 3 27,49 16,41 16,99 2,71 11,28 16,78 29,24 14,44 Nov3 34,6 26,64 37,93 42,1 14,3 3,45 63,66 35,13 Dic3 31,81 36,99 41,6 32,67 nd 4,3 35,29 33,19 Gen 4 47,33 35,29 63,22 51,91 19,25 36,59 46,54 39,34 Feb4 52,32 39,31 75,23 62,67 24,3 34,31 nd 33,48 Apr4 34,61 19,36 2,93 15,7 17,6 18,87 2,65 17,23 Lug 4 25,41 23,77 18,33 28,61 18,7 14,93 17,77 16,75 Nov4 43,47 65,68 42,48 93,53 31,91 41,33 37,74 29,65 Dic4 29,84 36,19 43,22 61,59 38,78 46,41 nd 39,2 Tabella 6. Confronto fra concentrazione (µg/nm 3 ) di polveri (PM 2,5 ) e numero di revertenti/nm 3 totali. gen-1/dic-4 Città R 2 Piacenza,7,5 Modena,3 Forlì,4 Pag. 11 di 29

15 Figura 4. Rete Regionale di Monitoraggio della Genotossicità del particolato atmosferico urbano (frazione PM 2,5 ), Arpa Emilia-Romagna. Andamenti comparati della mutagenicità del particolato atmosferico urbano, frazione PM 2,5, espressa come sommatoria dei revertenti/nm 3 indotti da estratti di campioni mensili e della concentrazione (medie mensili) delle polveri (µg/nm 3 ), nelle città e nei periodi indicati revertenti/nm peso polveri (µg/nm 3 ) gen-1 feb-1 apr-1 lug-1 nov-1 dic-1 gen-2 feb-2 apr-2 lug-2 nov-2 dic-2 gen-3 feb-3 apr-3 lug-3 nov-3 dic-3 gen-4 feb-4 apr-4 lug-4 nov-4 dic-4 PC rev/nm3 PR rev/nm3 MO rev/nm3 PC PM2,5 (ug/nm3) PR PM2,5 (mg/nm3) MO PM2,5 (ug/nm3) In collaborazione con l Eccellenza Microinquinanti organici (Arpa Emilia-Romagna, Sezione Provinciale di Ravenna), a partire dal 23, negli stessi estratti della frazione PM 2,5 del particolato atmosferico urbano da sottoporre a test di mutagenesi, è stata determinata la concentrazione degli IPA riportati nella sezione Materiali e metodi. Il confronto con i risultati dei test di mutagenesi è stato fatto con i seguenti IPA ad attività biologica:,, benzo(a)antracene, crisene, benzo(b), benzo(k), benzo(e), benzo(a), indeno(1,2,3- cd), dibenzo(a,h)antracene, benzo(ghi)perilene, dibenzo(a,h)antracene, dibenzo(a,e), dibenzo(a,i), dibenzo(a,h). Nei grafici (Fig.5) si riportano le medie stagionali delle concentrazioni dei singoli IPA rilevati nei periodi invernali ed autunnali. Pag. 12 di 29

16 Figura: 5 - Rete Regionale di Monitoraggio della Genotossicità del particolato atmosferico urbano (frazione PM 2,5 ), Arpa Emilia-Romagna. Concentrazioni medie stagionali, espresse come ng/nm 3 di aria, degli IPA indicati, rilevate nei periodi riportati, negli stessi estratti di particolato atmosferico sottoposti a test di mutagenesi. Inverno (gen-feb) 23 (FE e PC nr) 4,5 4, 3,5 IPA ng/nm 3 3, 2,5 2, 1,5 1,,5, antracene crisene benzo b benzo k fuorantene benzo e indeno (1,2,3,c,d,) benzo g,h,i perilene Dibenzo totali Piacenza Modena Bologna Ferrara Forlì Cesena Rimini Autunno (nov-dic) 23 4,5 4, 3,5 IPA ng/nm 3 3, 2,5 2, 1,5 1,,5, antracene crisene benzo b benzo k fuorantene benzo e indeno (1,2,3,c,d,) benzo g,h,i perilene Dibenzo totali Piacenza Modena Bologna Ferrara Forlì Cesena Rimini Inverno (gen-feb) 24 (Cesena nr) 4,5 4, 3,5 IPA ng/nm 3 3, 2,5 2, 1,5 1,,5, antracene crisene benzo b benzo k fuorantene benzo e indeno (1,2,3,c,d,) benzo g,h,i perilene Dibenzo totali Piacenza Modena Bologna Ferrara Forlì Cesena Rimini Pag. 13 di 29

17 Autunno (nov-dic) 24 4,5 4, 3,5 3, 2,5 2, 1,5 1,,5, antracene crisene benzo b benzo k fuorantene benzo e indeno (1,2,3,c,d,) benzo g,h,i perilene Dibenzo totali IPA ng/nm 3 Piacenza Modena Bologna Ferrara Forlì Cesena Rimini Le concentrazioni degli IPA seguono lo stesso andamento in tutti i nodi della rete, evidenziando come il tipo di inquinamento sia il medesimo in tutta la regione; si nota inoltre che, anche se a livelli diversi a seconda del sito, vi è una costante prevalenza di benzo(b), di indeno(1,2,3-cd) e di benzo(ghi)perilene, rispetto agli altri IPA monitorati, questo soprattutto nel periodo autunnale. In letteratura (EPA, 1998) il benzo(ghi)perilene è ritenuto un marcatore delle emissioni dei motori a benzina e diesel, mentre il benzo(b) delle emissioni diesel, la presenza costante di questi IPA nelle città della nostra regione sottolinea, quindi, il contributo del traffico veicolare all inquinamento. Per verificare il contributo degli IPA nel determinare la mutagenicità del PM sono state costruite delle rette di regressione tra le concentrazioni di IPA mutageni (ng/νm 3 ) e il numero di revertenti/νm 3 rilevati con i quattro singoli test. I coefficienti di determinazione R 2 (Tab.7) ottenuti sono risultati piuttosto differenti tra un sito di campionamento e l altro. Una buona correlazione tra IPA e numero di revertenti indotti è stata riscontrata per Piacenza e per Forlì soprattutto con il ceppo TA98. Tuttavia la correlazione risulta indipendente dal tipo di test utilizzato e si rileva non solo nei test più sensibili alla presenza di promutageni (quali sono gli IPA), ma anche nei test condotti in assenza di attivazione metabolica, suggerendo che gli IPA non sono le sole molecole responsabili della mutagenicità del particolato atmosferico e che un forte contributo è dato anche da sostanze ad azione mutagena diretta. Pag. 14 di 29

18 Tabella: 7 Confronto fra concentrazioni (ng/µg) di IPA totali (riportati nel testo) e numero di revertenti/µg rilevati nel periodo gennaio 23 dicembre 24. Coefficienti di determinazione - R 2 PC* PR MO* BO* FE FO Cesena* RN TA 98,9,5,4,7,8,8,5,2 TA 98 +,8,6,4,6,8,8,6,2 TA 1,7,7,3,5,5,6,5,3 TA1+,7,5,4,4,6,8,7,5 (TA98+)+(TA1+),7,6,4,5,7,8,7,4 TA98+TA1,8,6,4,6,6,7,6,3 *: PC, da novembre 23; BO, da febbraio 23; FE, da luglio 23; Cesena, mancano feb e dic 24 Questo lo si evidenzia bene dal confronto tra le concentrazioni di IPA (ng/µg di polveri) e il numero dei revertenti/µg sia in presenza (più sensibili all azione degli IPA) che in assenza di attivazione metabolica esogena (Fig.7). I confronti sono stati effettuati solo nei periodi autunnali e invernali, ritenuti più significativi sia per la presenza di IPA che per l attività mutagena del PM. Inoltre, dalla figura 7 si nota un evidente variabilità tra i livelli di IPA e la mutagenicità del PM sia fra i diversi nodi della rete che nell ambito di uno stesso nodo in periodi differenti. Infatti, come riscontrato per la concentrazione di polveri, a livelli comparabili di IPA si possono riscontrare valori piuttosto differenti di revertenti. Pag. 15 di 29

19 Figura: 7 - Rete Regionale di Monitoraggio della Genotossicità del particolato atmosferico urbano (frazione PM 2,5 ), Arpa Emilia-Romagna Stazioni di rilevamento: Piacenza,, Modena, Bologna, Ferrara, Forlì, Cesena e Rimini. Comparazione dei livelli medi mensili degli IPA mutageni riportati nel testo e di attività genotossica con i test sui ceppi TA98 e TA1 con e senza attivazione metabolica (S9) nelle stagioni indicate 4 autunno'3 inverno'3 inverno'4 autunno'4 1, Modena Forlì Cesena Rimini Piacenza Modena Bologna Ferrara Forlì Cesena Rimini Piacenza Modena Bologna Ferrara Forlì Cesena Rimini Piacenza Modena Bologna Ferrara Forlì Cesena Rimini revertenti/ µg di polveri,8,6,4,2 IPA totali (ng/µg), (TA98+S9)+(TA1+S9)/ug (TA98+TA1)/ug IPA tot (ng/ug) Test dei micronuclei Il test ha mostrato una tendenza generale all aumento dell attività clastogena/aneugena del PM in relazione alla dose come si può vedere dai dati relativi al mese di febbraio 24 (Fig. 8A), anche se solo il campione di Bologna risulta positivo all ultima dose (chi quadrato, p<,5). I micronuclei indotti per normal metro cubo di aria sono stati messi a confronto sia con le concentrazioni di IPA che con quelle di polveri (Fig.8B) ottenendo, dalle rette di regressione, valori di R 2 che si attestano in entrambe i casi intorno allo,6 con una notevole dispersione dei dati intorno alle rette, soprattutto per quel che riguarda il confronto con la concentrazione di polveri (dati non riportati). Per finire, i risultati di questo test sono stati confrontati con quelli ottenuti in Salmonella (Fig.8C): non si evidenzia una netta corrispondenza tra il numero dei revertenti totali ottenuti in Salmonella e il numero di micronuclei indotti dal medesimo campione. Pag. 16 di 29

20 Figura: 8 - Rete Regionale di Monitoraggio della Genotossicità del particolato atmosferico urbano (frazione PM 2,5 ), Arpa Emilia-Romagna A: Micronuclei (MN) indotti (su mille linfociti binucleati-bn) da dosi crescenti di estratti di PM2,5 nel periodo e nelle città indicate (chi quadrato, p<.5). B: Confronto tra la concentrazione media di polveri (µg/nm3), di IPA totali (ng/nm3) e MN indotti per Nm3 nelle città e nei mesi indicati.. C: Confronto fra MN e revertenti totali indotti per Nm3 di aria nelle città e nei mesi indicati. A Febbraio MN su 1 BN * B PR BO FE RN Nm3 2 Nm3 4 Nm3 8 Nm3 8 1,8 conc. polveri e IPA Feb. '4 Lug. '4 1,5 1,2,9,6,3 MN/Nm3 PR BO FE RN PR BO FE RN, C conc. polveri ug/nm3 IPA TOT ng/nm3 MN/Nm3 12 1,8 1 1,5 rev/nm ,2,9,6 MN/Nm3 2,3 PR BO FE RN PR BO FE RN FEB_4 LUG _4, rev tot/nm3 MN/Nm3 Pag. 17 di 29

21 PM 1 A e a Ravenna, a differenza degli altri nodi della rete, viene monitorata la mutagenicità della frazione PM 1. A il sito di campionamento (Tab.1), è lo stesso del PM 2,5 ; a Ravenna, invece, la stazione di campionamento è situata in un parco cittadino. Come per il PM 2,5, i test di mutagenesi sono stati effettuati sul particolato campionato nei mesi più significativi nell ambito di ogni stagione (vedi Introduzione). Osservando l evoluzione temporale della mutagenicità del particolato atmosferico, espressa sia come fattore di genotossicità totale mensile (Tab.8) che come numero dei revertenti/nm 3 di aria (medie stagionali) (Fig.9), si riscontrano, come già riportato per il PM 2,5, una presenza costante di sostanze mutagene con valori più elevati nei periodi autunno-invernali e minimi nei periodi più caldi, senza un trend evidente. In generale si possono osservare valori più elevati (t di Student, p<.5) a Ravenna rispetto a, senza particolari differenze di carattere qualitativo. I valori più elevati sono stati rilevati nel periodo autunno 21 inverno 22, soprattutto per quanto riguarda Ravenna. Tabella 8 Stazioni di rilevamento: e Ravenna. Mutagenicità del particolato atmosferico urbano (PM 1 ) rilevata come Fattore di Genotossicità su tutti i test in Salmonella typhimurium. Intervalli di positività Giudizio FG 1,4 negativo 1,5 FG 2,9 debolmente positivo 3, FG 14,9 positivo FG 15, fortemente positivo Ravenna Ravenna Gen-1 11,5 29,2 Gen-3 26,1 87,3 Feb-1 9,8 23,4 Feb-3 34,5 41,3 Apr-1 3,4 5,1 Apr-3 4,2 1,8 Lug-1,7 2,1 Lug-3,9 2, Nov-1 25,4 37,9 Nov-3 1,4 14,5 Dic-1 44,6 149,5 Dic-3 3,5 23,7 Gen-2 45,9 19,5 Gen-4 17,4 43,4 Feb-2 23,9 45,9 Feb-4 23,5 26,9 Apr-2 6,4 5,8 Apr-4 2,3 6,8 Lug-2,7 3,4 Lug-4,8 1,* Nov-2 1,9 53,9 Nov-4 26,3 47,2 Dic-2 17,8 37, Dic-4 13,9 35,7 *: dato di agosto Figura 9. - Stazioni di rilevamento: e Ravenna. Mutagenicità del particolato atmosferico urbano (PM 1 ) rilevata come numero medio (medie stagionali: autunnali e invernali) di revertenti/nm 3 di aria, rilevata nei periodi e nei siti indicati. Pag. 18 di 29

22 Ravenna inv '1 aut '1 inv '2 aut '2 inv '3 aut '3 inv '4 aut '4 inv '1 aut '1 inv '2 aut '2 inv '3 aut '3 inv '4 aut '4 Revertenti/Nm 3 TA98 TA98+ TA1 TA1+ La correlazione tra concentrazione (µg/nm 3 ) di polveri (PM 1 ) e numero di revertenti/nm 3 totali nelle due città (Tab.9) è modesta e il differente livello di mutagenicità del particolato atmosferico non sembra essere imputabile a differenze nella concentrazione di PM 1. Infatti in alcuni mesi la concentrazione di polveri risulta più elevata a, mentre il numero di revertenti per Nm 3 è più alto a Ravenna (Fig. 1,11). Occorre comunque tenere in considerazione il fatto che la determinazione del peso delle polveri non viene effettuata con lo stesso metodo (vedi Report ). Pag. 19 di 29

23 Figura 1. Concentrazioni (medie mensili)di particolato atmosferico (PM 1 ) (µg/nm 3 ). PM1 Ravenna µg/nm gen-1 feb-1 apr-1 lug-1 nov-1 dic-1 gen-2 feb-2 apr-2 lug-2 nov-2 dic-2 gen-3 feb-3 apr-3 lug-3 nov-3 dic-3 gen-4 feb-4 apr-4 lug-4 nov-4 dic-4 Figura 11. Andamenti comparati della mutagenicità del particolato atmosferico urbano, frazione PM 1, espressa come sommatoria dei revertenti/nm 3 indotti da estratti di campioni mensili e della concentrazione (medie mensili) delle polveri (µg/nm 3 ), nelle città e nei periodi indicati revertenti/nm peso polveri (µg/nm 3 ) 2 1 nd 2 gen-1 feb-1 apr-1 lug-1 nov-1 dic-1 gen-2 feb-2 apr-2 lug-2 nov-2 dic-2 gen-3 feb-3 apr-3 lug-3 nov-3 dic-3 gen-4 feb-4 apr-4 lug-4 nov-4 dic-4 PR rev/nm3 RA rev/nm3 PR PM1 (ug/nm3) RA PM1 (ug/nm3) Tabella 9. Confronto fra concentrazione (µg/nm 3 ) di polveri (PM 1 ) e numero di revertenti/nm 3 totali. gen-1/dic-4 Città R 2,5 Ravenna,6 Pag. 2 di 29

24 Anche negli estratti di PM 1 campionato a e a Ravenna sono state determinate le concentrazioni di IPA; nei grafici (Fig.12) si riportano le concentrazioni dei seguenti IPA con attività biologica:,, benzo(a)antracene, crisene, benzo(b), benzo(k), benzo(e), benzo(a), indeno(1,2,3-cd), dibenzo(a,h)antracene, benzo(ghi)perilene, dibenzo(a,h)antracene, dibenzo(a,e), dibenzo(a,i), dibenzo(a,h). Questi grafici evidenziano che gli IPA sono presenti, generalmente, in concentrazione maggiore negli estratti di PM 1 campionato a Ravenna e questo è particolarmente evidente, a partire dall autunno 23, per il benzo(b), l indeno(1,2,3,c,d) e il benzo(ghi)perilene. Dalle rette di regressione, ottenute mettendo in relazione il numero di revertenti/µg rilevati con i singoli test con le concentrazioni di IPA mutageni (ng/µg) presenti nei medesimi estratti, sono stati ottenuti i coefficienti di determinazione R 2 (Tab.1). Il valore piuttosto basso degli R 2, soprattutto per Ravenna porta ad ipotizzare che, anche in questo caso, gli IPA non siano le sole molecole responsabili della mutagenicità del particolato atmosferico, ma che un forte contributo sia dato alla mutagenicità del particolato, anche da sostanze ad azione mutagena diretta come si può osservare dai dati rappresentati in Figura13. Come riscontrato per il PM 2,5, anche per quanto riguarda il PM 1 campionato a e a Ravenna, si evidenzia come, spesso, a concentrazioni simili di IPA, possano corrispondere valori di mutagenicità piuttosto differenti. Pag. 21 di 29

25 Tabella 1. Confronto fra concentrazioni (ng/µg) di IPA totali (riportati nel testo) e numero di revertenti/µg rilevati nel periodo gennaio 21 dicembre 24. Ravenna Coefficienti di determinazione - R 2 TA 98,5 TA 98 +,5 TA 1,5 TA1+,5 (TA98+)+(TA1+),5 TA98+TA1,5 TA 98,3 TA 98 +,3 TA 1,4 TA1+,4 (TA98+)+(TA1+),4 TA98+TA1,4 Pag. 22 di 29

26 Figura Stazioni di rilevamento: e Ravenna. Concentrazioni medie stagionali autunnali e invernali), espresse come ng/nm 3, degli IPA indicati, rilevate nei periodi riportati negli stessi estratti di particolato atmosferico (PM 1 ) sottoposti a test di mutagenesi. Autunno (nov-dic) 21 4,5 4, 3,5 3, 2,5 2, 1,5 1,,5, antracene crisene benzo b benzo k fuorantene benzo e indeno (1,2,3,c,d,) benzo g,h,i IPA ng/nm 3 perilene Dibenzo totali PR RA Inverno (gen-feb) 22 4,5 4, 3,5 IPA ng/nm 3 3, 2,5 2, 1,5 1,,5, antracene crisene benzo b benzo k fuorantene benzo e indeno (1,2,3,c,d,) benzo g,h,i perilene Dibenzo totali PR RA Autunno (nov-dic) 22 4,5 4, 3,5 IPA ng/nm 3 3, 2,5 2, 1,5 1,,5, antracene crisene benzo b benzo k fuorantene benzo e indeno (1,2,3,c,d,) benzo g,h,i perilene Dibenzo totali PR RA Inverno (gen-feb) 23 4,5 4, 3,5 IPA ng/nm 3 3, 2,5 2, 1,5 1,,5, antracene crisene benzo b benzo k fuorantene benzo e indeno (1,2,3,c,d,) benzo g,h,i perilene Dibenzo totali PR RA Pag. 23 di 29

27 Autunno (nov-dic) 23 4,5 4, 3,5 IPA ng/nm 3 3, 2,5 2, 1,5 1,,5, antracene crisene benzo b benzo k fuorantene benzo e indeno (1,2,3,c,d,) benzo g,h,i perilene Dibenzo totali PR RA Inverno (gen-feb) 24 4,5 4, 3,5 IPA ng/nm 3 3, 2,5 2, 1,5 1,,5, antracene crisene benzo b benzo k fuorantene benzo e indeno (1,2,3,c,d,) benzo g,h,i perilene Dibenzo totali PR RA Autunno (nov-dic) 24 4,5 4, 3,5 IPA ng/nm 3 3, 2,5 2, 1,5 1,,5, antracene crisene benzo b benzo k fuorantene benzo e indeno (1,2,3,c,d,) benzo g,h,i perilene Dibenzo totali PR RA Pag. 24 di 29

28 Figura Stazioni di rilevamento: e Ravenna. Comparazione dei livelli, medi stagionali, di IPA mutageni (riportati nel testo) e di attività genotossica determinata con tutti i test sui ceppi TA98 e TA1 con e senza attivazione metabolica (S9), nei periodi indicati. 4 inv'1 aut'14 inv'2 aut'2 inv'3 aut'3 inv'4 aut'4 1, Ravenna Ravenna Ravenna Ravenna Ravenna Ravenna Ravenna Ravenna revertenti/ µg di polveri,8,6,4,2, IPA totali (ng/µg) (TA98+S9)+(TA1+S9)/ug (TA98+TA1)/ug IPA tot (ng/ug) Pag. 25 di 29

29 CONCLUSIONI Le differenze quali-quantitative della mutagenicità dei campioni prelevati nei diversi nodi della rete, sia PM 2,5 che PM 1, evidenziano come il particolato atmosferico urbano sia una miscela complessa di sostanze mutagene in grado di subire notevoli variazioni nel tempo. In particolare dall analisi dei dati ottenuti in questo ultimo periodo di monitoraggio è emerso, ad esempio, in maniera evidente, che la mutagenicità del PM campionato a Rimini, contrariamente agli anni precedenti in cui la mutagenicità era a livelli molto bassi, rispetto agli altri nodi della rete, dall inizio del 23 ha subito un forte incremento. A Forlì e vi è stato un cambiamento qualitativo del PM, infatti, agli inizi del 22 si è assistito al cambiamento nel rapporto fra mutageni diretti e indiretti che inducono sostituzione di base. I risultati delle analisi sugli IPA hanno rimarcato come, in maniera simile a quanto osservato per le concentrazioni di polveri, di CO e di NO 2, non sia possibile descrivere gli effetti genotossici di matrici ambientali, quali il PM, con una o poche classi di inquinanti chimico-fisici essendo una miscela costituita da numerose sostanze non tutte identificabili e/o quantificabili e che possono interagire fra di loro. Infine l applicazione del test dei micronuclei, in concomitanza col test su Salmonella, ha dimostrato che l utilizzo di test biologici con end-points genetici diversi permette di evidenziare la presenza di sostanze genotossiche in grado di agire con differenti meccanismi di azione. La presenza di particelle ultrafini e la loro attività biologica rappresenta un importante fattore di rischio per la salute dei cittadini: risulta quindi necessario impegnare risorse nella prevenzione primaria dei rischi sanitari connessi con questi inquinanti ambientali. La rete di monitoraggio della mutagenicità del PM garantisce la valutazione continua nel tempo e su tutto il territorio dell Emilia-Romagna della genotossicità del particolato atmosferico urbano, fornendo, in ambito analitico/preventivo, importanti informazioni per una migliore caratterizzazione del pericolo per la popolazione urbana cronicamente esposta e per la valutazione dell efficacia delle azioni nazionali e locali tese al risanamento dell aria in ambiente urbano. Dott.ssa Francesca Cassoni Responsabile Eccellenza Mutagenesi Ambientale Pag. 26 di 29