Modulo 11: Membrane e trasporto transmembrana. a.a

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1 Modulo 11: Membrane e trasporto transmembrana a.a

2 Le funzioni delle membrane biologiche Membrane formano barriere fisiche. Separano il citosol dall ambiente esterno preservano l individualità della cellula mantenendola separata dall ambiente circostante. Delimitano i compartimenti intracellulari (nucleo, mitocondri, ER, lisosomi ecc.) Hanno funzioni di trasporto di metaboliti, di ioni. Permettono la comunicazione tra ambiente esterno ed interno attraverso recettori proteici. Attuano la conversione dell energia chimica attraverso la formazione di gradienti elettrochimici

3 Le membrane biologiche: proprietà Le membrane biologiche sono strutture laminari simili a fogli con spessori compresi tra 5 e 8 nm. Costituite principalmente da glicerofosfolipidi, sfingolipidi, colesterolo. Strutture senza legami covalenti tra le unità di base, le unità che le compongono sono tenute unite da interazioni non covalenti. Le membrane sono asimmetriche e di norma elettricamente polarizzate Permeabilità molto bassa per la maggior parte delle molecole. Contengono proteine specifiche e particolari responsabili di funzioni specializzate delle membrane. Distribuzione dei lipidi negli strati interno ed esterno della membrana plasmatica (eritrociti)

4 Aggregati di lipidi anfipatici che si formano in acqua L effetto idrofobico costituisce la forza termodinamica trainante per la formazione e stabilizzazione di questi raggruppamenti di molecole lipidiche. A seconda della natura chimica dei lipidi si possono formare i tre tipi di aggregati. Micelle: quando la superficie della sezione trasversale della della testa polare è più grande di quella della coda acilica. (detergenti, lisofosfolipide); doppio strato/liposoma: quando la superficie della sezione trasversale della testa e delle catene aciliche è simile (glicerofofolipidi, sfingolipidi).

5 Il modello a mosaico fluido Caratteristiche comuni a tutte le membrane: sono strutture fluide e dinamiche. Fluidità di membrana: data dalle interazioni non covalenti, lasciano libere le molecole di spostarsi lateralmente nel piano della membrana. Le membrane biologiche sono soluzioni bidimensionali di lipidi orientati e proteine globulari (Singer & Nicholson1972) Membrane paragonate a un liquido bidimensionale. Le proteine galleggiano nel liquido bidimensionale.

6 La fluidità di membrana è controllata dalla composizione lipidica Le catene aciliche sono in uno stato di liquido ordinato (semisolido). Le catene aciliche sono in uno stato di liquido disordinato La temperatura (T m ) di transizione fluido (liquido cristallino)-solido (gel) dipende dalla lunghezza delle catene degli acidi grassi, dal loro grado di insaturazione e dalla presenza di colesterolo. La presenza di doppi legami rende le catene più irregolari diminuendo il numero di legami possibili tra le catene, rendendo le catene più fluide. Gli animali a sangue freddo modificano la composizione in acidi grassi dei lipidi di membrana a seconda della T.

7 Il colesterolo è il principale modulatore della fluidità delle membrane degli animali Il colesterolo si inserisce nel doppio strato lipidico e si impacca tra i fosfolipidi/sfingolipidi Ha un duplice effetto: 1. con la sua struttura rigida spezza la regolarità dei legami tra catene aciliche sature rendendo la struttura meno ordinata (più fluida) 2. Aumenta il grado di impaccamento delle catene aciliche insature rendendo meno fluida la membrana. L effetto finale è uno smorzamento dei cambiamenti di fluidità della membrana

8 Movimento dei lipidi nel doppio strato lipidico I lipidi inseriti nelle membrane sono soggetti ad una rapida diffusione laterale: 1 m 2 S -1 Mentre la diffusione trasversale è molto limitata (se non catalizzata). Tre enzimi promuovono il trasferimento di specifici lipidi da un lato all altro della membrana. Le flippasi e le floppasi contribuiscono alla distribuzione asimmetrica. le scramblasi la riducono. PE= fosfatidiletanolammina PS= fosfatidilserina

9 I lipidi si spostano lateralmente nel doppio strato Misura della velocità di diffusione laterale dei lipidi tramite FRAP ( recupero della fluorescenza dopo fotospegnimento). I lipidi sono marcati con una molecola fluorescente (rosso). Una piccola aerea intensamente irradiata si sbianca (perde la fluorescenza) dopo un breve tempo la diffusione riempie la zona che ritorna fluorescente. Diffusione a salto di singole molecole lipidiche (videomicroscopia a fluorescenza t = 56 msec ( fotogrammi/sec)

10 I principali componenti lipidici delle membrane biologiche Ogni membrana plasmatica o interna (organuli) ha una sua composizione lipidica ben precisa. Es. epatocita di ratto. La specializzazione funzionale di ogni tipo di membrana dipende dalla sua composizione.

11 Variazioni della composizione associate al traffico di membrana

12 La membrana plasmatica presenta microdomini (zattere) Associazioni stabili di sfingolipidi e colesterolo nel foglietto esterno producono microdomini: leggermente più densi delle altre regioni ricche in specifici tipi di proteine: le proteine ancorate a GPI si trovano spesso in questi microdomini. Le altre proteine ancorate alla membrana spesso si trovano nel foglietto interno.

13 Fusione delle membrane

14 Le proteine di membrana Ogni tipo di cellula possiede un set specifico di proteine di membrana che consente di compiere funzioni specifiche Le funzioni principali : trasporto, comunicazione, produzione di energia, locomozione

15 Proteine periferiche e integrali di membrana Le proteine di membrana possono essere classificate a seconda dal mezzo con cui vengono rimosse dalla membrana Le proteine integrali attraversano strato lipidico formando interazioni idrofobiche con i lipidi. 1 monopasso; 2 multipasso; 3. barile ß; 4 Inserita su un solo lato Le proteine periferiche sono associate con le membrane attraverso interazioni con proteine integrali (7,8) oppure sono ancorate alla membrana da legami covalenti con lipidi (5,6).

16 Proteine di membrana ancorate ai lipidi Vari modi con cui le proteine sono ancorate alla membrana GPI: glicosilfosfatidilinositolo (GPI) un fosfolipide complesso legato all estremità carbossiterminale della proteina.

17 Disposizione della glicoforina nella membrana dell eritrocita

18 Proteine integrali: multipasso ad -elica Le proteine che attraversano il doppio strato lipidico (3 nm) comunemente formano -eliche di circa 20 aa con un elevato numero di residui idrofobici Esempio la batteriorodopsina, un trasportatore batterico di protoni H+, è formato da un fascio di 7 segmenti idrofobici ad alfa elica (multipasso), che attraversano il doppio strato lipidico. I 7 segmenti transmembrana possono essere individuati analizzando la sequenza aa (indice idropatico)

19 Proteine integrali: canali proteici formati da catene β Proteine di membrana con poro centrale posso anche avere una struttura formata esclusivamente da foglietti beta di catene antiparallele. Il canale interno è idrofilico. Le pareti esterne sono idrofobiche. Sequenza amino acidica La porina è una proteina di membrana esterna dei batteri Gram-negativi. I residui in giallo (idrofobici) sono rivolti all esterno quelli bianchi verso l interno del canale della porina I trattini indicano i legami idrogeno che stabilizzano la struttura secondaria

20 Le membrane biologiche sono selettivamente permeabili La permeabilità delle piccole molecole è correlata alla loro solubilità in un solvente non polare relativamente a quello dell acqua. Coefficienti di permeabilità, P (cm S -1 ) di alcuni soluti attraverso le membrane I gas, l acqua, e alcune sostanze lipofiliche (ormoni steroidei) hanno sufficiente permeabilità e si muovono per diffusione semplice, dalle regioni di maggiore concentrazione a quelle a minor concentrazione. Le molecole polari, idrofiliche e ioniche (gli ioni hanno P di 10 9 volte inferiori a quello dell acqua) hanno bisogno di proteine di membrana per il loro movimento attraverso le membrane Video su membrane transport :

21 Meccanismi di trasporto trans-membrana Oltre alla diffusione semplice: Trasporto passivo Il passaggio secondo concentrazione di composti polari ed ioni avviene per diffusione facilitata (trasporto facilitato, trasporto passivo) ad opera di trasportatori proteici selettivi. Il trasporto di ioni è mediato da trasportatori (ionofori) o canali ionici. Trasporto attivo Alcune sostanze vengono concentrate: il passaggio avviene con consumo di energia ad opera di specifici trasportatori (pompe). Avviene con consumo di ATP (primario) o fruttando il movimento spontaneo di uno ione (secondario).

22 Trasporto di soluti attraverso le membrane Il movimento di una molecola elettricamente neutra attraverso un membrana permeabile avviene in direzione della minor concentrazione (secondo gradiente di concentrazione = distribuzione disuguale di concentrazione) fino a raggiungere l equilibrio molecola elettricamente neutra + - molecola carica Il movimento di una molecola carica (senza spostare una di segno opposto) genera un gradiente elettrico transmembrana (potenziale di membrana V m espresso in V o mv). Il movimento di una molecola carica avverrà in direzione di diminuire il potenziale di membrana.

23 Il trasporto passivo è facilitato da proteine di membrana Il passaggio transmembrana di molecole polari o cariche richiede energia (paragonabile all energia di attivazione ΔG ǂ ). Proteine che forniscono una via alternativa (Trasportatori o permeasi) (in blu) facilitano il trasporto. I trasportatori possono essere paragonabili a catalizzatori proteici.

24 Il trasporto passivo avviene per mezzo proteine di trasporto e canali I trasportatori sono proteine transmembrana multipasso. Ogni trasportatore è altamente selettivo per uno o pochi tipi di composti, si lega al ligando tramite uno specifico sito di legame. Due tipi: Trasportatori (proteine trasportatrici): legano le molecole da un lato della membrana e in seguito ad un cambiamento conformazionale della proteina le depositano dall altro. Il trasporto è saturabile. Canali ionici: formano un poro idrofilico (canale acquoso) all interno della membrana che permette la diffusione di ioni specifici attraverso la membrana. Non sono saturabili dal substrato. L apertura del canale può essere regolata.

25 Il trasportatore del glucosio Trasportatore del glucosio GLUT-1, proteina transmembrana che permette un trasporto (passivo) volte superiore alla diffusione semplice. Il processo di trasporto può essere descritto come una reazione enzimatica con [S] esterno e [S] interno. Kt est est Cinetica di trasporto del glucosio nell eritrocita e grafico dei doppi reciproci Kt (trasporto) è una costante che ha lo stesso significato di Km

26 Struttura del trasportatore per il glucosio GLUT1 Trasportatore (GLUT-1) proteina 55 kda con 12 eliche transmembrana. b) rappresentazione di una delle eliche in cui si nota il carattere anfipatico. c) associazione di eliche a formare un poro centrale d) struttura di GLUT1 in conformazione aperta verso t2.

27 Modello del trasporto del glucosio Ci sono 2 conformazioni alternative, T 1 sporge all esterno, T 2 sporge all interno. Ognuna è in grado di legare il glucosio con siti di legame esposti sulle due superfici. Il trasporto può avvenire in entrambe le direzioni, avviene dal comparto in cui il glucosio è più concentrato a quello in cui lo è meno. * Il glucosio non è in scala rispetto alla membrana

28 I trasportatori del glucosio nell uomo

29 Classificazione dei sistemi di trasporto In base al numero di soluti i sistemi di trasporto sono classificabili in: uniporto, simporto e antiporto.

30 Antiporto cloruro-bicarbonato nella membrana dell eritrocita Lo scambio è elettroneutrale

31 Variazione di energia (libera) durante il trasporto attivo di un soluto non carico Un soluto elettricamente neutro si muove verso la regione dove la sua concentrazione è minore fino all equilibrio. Per una specie molecolare non carica il lavoro per portare una molecola di concentrazione c 1 da un lato della membrana all altro lato in cui si trova ad una concentrazione c 2 superiore è dato da: ΔG= RTln(c 2 /c 1 ) = 2,3 RT log 10 (c 2 /c 1 ) R= costante dei gas (8,3 x10-3 kj mol -1 K-1 ) T= Temperatura in gradi Kelvin Il trasporto attivo è essenziale per concentrare sostanze. La distribuzione disuguale di concentrazione (gradiente), determina una condizione ricca di energia. Per formare un gradiente è necessario spendere energia (trasporto attivo). molecola elett. neutra

32 Variazione di energia (libera) per il trasporto di una molecola carica Lo spostamento di una carica (senza spostare una di segno opposto) genera un potenziale elettrico. E un trasporto elettronegico. Il costo energetico del movimento di uno ione da un lato della membrana all altro lato dipende da: ΔG= 2,3 RTlog 10 (c 2 /c 1 ) + ZF ΔV Z = carica della specie trasportata F = costante di Faraday = 96,5 kj V -1 mol -1 V = potenziale elettrico (potenziale di membrana) + - molecola carica potenziale elettrochimico = gradiente di concentrazione (chimico) + potenziale elettrico Per potenziale di membrana si intende il potenziale elettrico, misurabile in una cellula. Tutte le tipologie cellulari presentano un potenziale di membrana che si aggira tra -60 mv e -70 mv. Il segno meno indica proprio che l'interno della cellula è carico negativamente.

33 Il trasporto attivo trasferisce un soluto contro gradiente di concentrazione o elettrochimico Se per portare una molecola di concentrazione c 1 da un lato della membrana all altro lato in cui si trova alla concentrazione c 2 risulta che: ΔG= 2,3 RTlog 10 (c 2 /c 1 ) + ZF ΔV >0 Questa è una condizione di trasporto contro gradiente elettrochimico e per trasportare la molecola è necessario spendere energia (trasporto attivo). Trasportare attivamente significa concentrare. Trasporto primario: accumulo della molecola S 1 è accoppiato ad una reazione esoergonica: Conversione di ATP in ADP Trasporto secondario: accumulo della molecola S 2 è accoppiato ad un secondo trasporto esoergonico (in direzione di gradiente) della molecola S 1 :

34 Composizione salina e trasporto di ioni I gradienti ionici negli organismi sono mantenuti da un sistema di trasporto: pompa Na+-K+ (ATPasi) Ione Na + K + Ca ++ liquido extracellulare 140 mm 4 mm 2.5 mm liquido intracellulare 14 mm 140 mm 0.1 M Rapporto out/in 10:1 1: :1 Cl mm 4 mm 25:1 ATPasi di tipo P comprendono trasportatori di cationi. L energia è fornita dall idrolisi dell ATP che catalizza la formazione di un composto fosforilato P. Struttura generale delle ATPasi di tipo P Esempi: uniporto ATPasi Ca++ (SERCA) antiporto ATPasi Na+ K+ delle cellule animali ATPasi H+ delle cellule delle piante Dominio A (Fosfatasi) Dominio T canale per lo ione (6 eliche)

35 Trasporto primario: il meccanismo della pompa per il calcio (SERCA) SERCA: pompa ATPasi per il calcio del reticolo endoplasmatico e sarcoplasmatico 1. Conformazione E1: siti di legame del Ca2+ esposti su lato citosolico l ATP si lega al sito N. 2. Il legame dell ATP determina la fosforilazione del substrato: Asp 351. che a sua volta promuove la transizione E1 in E2. 3. I siti del Ca2+ sono esposti verso il lato luminale del reticolo, l affinità è ridotta: il Ca2+ è rilasciato 4. Il dominio A nella conformazione E2-P si muove provocando il rilascio di ADP e la defosforilazione del dominio P. 5. La proteina ritorna nella sua conformazione originale EI.

36 La struttura della pompa del calcio Le ATPasi di tipo P sono simili tra loro. La Ca 2+ ATPasi del reticolo sarcoplasmatico dei miociti è stata studiata nel dettaglio. Rimuove rapidamente il Ca 2+ dal citoplasma e lo trasferisce al reticolo sarcoplasmatico promuovendo il rilassamento muscolare. E1 E2-P Ca ATPasi formata da un dominio transmembrana (giallo) con sito legame Ca, e parte citoplasmatica con domini A (adattatore), P (legame P) e N (legame Nucleotide ATP). Il trasportatore si può trovare nello stato E 1 (non fosforilata) o E 2

37 La Na + K + della membrana plasmatica

38 Trasportatori guidati da idrolisi dell ATP Altri trasportatori impiegati nel trasporto primario diverse dalle ATPasi di tipo P sono: ATPasi di tipo V: (vacuolari). Responsabili dell acidificazione dei lisosomi, endosomi. Trasportano H + ATPasi di tipo F (ATP sintasi): trasportano protoni. Funzionano come ATP sintetasi: Fattori di accoppiamento energetico: utilizzano gradienti di H per formare ATP nella fosforilazione ossidativa e fotofosforilazione. Trasportatori ABC. Trasportano attivamente amminoacidi, peptidi, proteine, ioni, vari lipidi, sostanze idrofobiche.

39 Due pompe protoniche con strutture simili Entrambe le ATPasi di topo V e tipo F sono formate da un dominio periferico che sporge nel citoplasma e che lega l ATP/ADP (V1 e F1) ed un dominio integrale di membrana che è un canale protonico (V0, F0).

40 Trasporto secondario: accumulo del glucosio nelle cellule intestinali. Esempio di trasporto secondario: Il co-trasporto di nutrienti attraverso le membrane delle cellule intestinali è un processo attivo che muove il glucosio contro gradiente di concentrazione. La fase che richiede energia per questo cotrasporto è: La Na+K+ATPasi che pompa il Na+ dalle cellule epiteliali al sangue mantenendo bassi i livelli di Na+ nella cellula Il simporto Na+-glucosio sulla superficie apicale che introduce glucosio nelle cellule favorito dal flusso di ioni Na+ secondo gradiente Il trasportatore del glucosio sulla superficie basale che versa il glucosio nel sangue secondo concentrazione.