RING TEST NAZIONALE PER LA RICERCA DI ANTICORPI NEI CONFRONTI DEL VIRUS DELLA MALATTIA DI AUJESZKY MEDIANTE TECNICA ELISA Anno 2012/2013

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1 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLA LOMBARDIA E DELL'EMILIA ROMAGNA BRUNO UBERTINI (ENTE SANITARIO DI DIRITTO PUBBLICO) BRESCIA Reparto di Virologia CENTRO DI REFERENZA NAZIONALE PER LA MALATTIA DI AUJESZKY Via Bianchi, 9 54 BRESCIA (Italy) Tel Fax virologia@izsler.it RING TEST NAZIONALE PER LA RICERCA DI ANTICORPI NEI CONFRONTI DEL VIRUS DELLA MALATTIA DI AUJESZKY MEDIANTE TECNICA ELISA Anno 0/03 REPORT FINALE CRMA Centro di Referenza Nazionale della Malattia di Aujeszky-Pseudorabbia IZSLER, Reparto di Virologia - Brescia Responsabile dott. Paolo Cordioli Tel paolo.cordioli@izsler.it

2 Premessa Con il DM il Ministero della Sanità conferisce all Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell Emilia Romagna (IZSLER), sede centrale di Brescia, la funzione di Centro di Referenza Nazionale (CNR) per la Malattia di Aujeszky Pseudorabbia. La Decisione della Commissione 93/44/CEE (poi abrogata e sostituita dalla Decisione della Commissione 00/68/CE) affida all Istituto anche il compito di valutare sistemi diagnostici (Kit ELISA ge) utilizzati in Italia per gli animali oggetto di scambi intercomunitari. I compiti istituzionali del CNR per la Malattia di Aujeszky sono quelli definiti nel DM , art. ; tra questi compiti vi è anche quello di organizzare circuiti interlaboratorio, o ring test, a livello nazionale. La partecipazione al circuito interlaboratorio e l adozione di eventuali misure correttive, qualora emergano criticità, consente ai laboratori di mantenersi coerenti con gli standard qualitativi richiesti. A diversi laboratori che hanno aderito al Ring Test 0/03, è stato inviato un identico pannello di 0 sieri; i dati ottenuti dai singoli laboratori sono stati trasmessi alla Sorveglianza Epidemiologica Lombardia che ha provveduto ad aggregarli ed analizzarli. Partecipanti In totale hanno aderito al Ring Test 4 laboratori dislocati su tutto il territorio nazionale (Tab. ) ad ognuno dei quali è stato assegnato un numero identificativo casuale da a 4. Tab.: Elenco dei laboratori che hanno aderito al Ring Test 0/03. IZS Piemonte, Liguria, Valle d Aosta IZS Lombardia, Emilia Romagna IZS Venezie IZS Lazio, Toscana IZS Umbria, Marche IZS Abruzzo, Molise IZS Mezzogiorno IZS Puglia, Basilicata IZS Sicilia IZS Sardegna Sede centrale di Torino - S.C. virologia Sede centrale di Torino - S.C. sierologia Sede centrale di Brescia - laboratorio virologia Sezione di Mantova Sezione di Parma Sezione di Reggio Emilia Sezione di Lodi Sezione di Pavia Sede centrale di Padova - S.C. 7 diagnostica virologica e sierologica Sezione di Treviso Sezione di Udine Sezione di Verona Sede centrale di Roma - D.O. malattie virali e leptospirosi Sede centrale di Perugia Sezione di Fermo Sede centrale di Teramo - Laboratorio di Sierologia Sede centrale di Portici, U.O.S. Diagnostica Virologica Sezione di Catanzaro- lab. sierologia Sede centrale di Foggia U.O. Virologia Sede centrale di Palermo Laboratorio diagnostica Virologica Sezione di Cagliari- lab. sierologia Sede centrale di Sassari lab. malattie esotiche Sezione di Oristano Sezione di Nuoro lab di virologia diagnostica

3 Riservatezza Il CRMA è impegnato a trattare i dati in forma confidenziale e riservata. I dati una volta aggregati potranno essere messi a disposizione del Ministero della Salute, dei Servizi Veterinari Regionali o di altri Uffici di Istituzioni competenti. Sieri utilizzati per il Ring Test della Malattia di Aujeszky 0/03 e risultati attesi Il pannello dei campioni distribuiti è costituito da 0 sieri di suino identificati con numeri progressivi da a 0. Di seguito viene riportata la descrizione dei singoli sieri e in tabella vengono riportati i risultati attesi. Descrizione dei sieri utilizzati nel pannello Siero : siero negativo ottenuto da suini SPF Siero : siero negativo ottenuto da suini SPF Siero 3: suino infettato per via endonasale con ceppo Bucarest; prelevato 0gg post infezione (pi) Siero 4: suino vaccinato 3 volte (4/8-4/9-6/0/006) con vaccino deleto inattivato Siero 5: suino vaccinato volta con vaccino deleto inattivato Siero 6: suino vaccinato volta con vaccino deleto inattivato Siero 7: suino vaccinato 3 volte (4/8-4/9-6/0/006) con vaccino deleto inattivato Siero 8: suino vaccinato 3 volte (4/8-4/9-6/0/006) con vaccino deleto inattivato Siero 9: suino vaccinato 5 volte con vaccino deleto inattivato e infettato sperimentalmente per contatto con ceppo ADV75D9; prelevato 5gg post contatto (pc) Siero 0: suino vaccinato 3 volte con vaccino deleto inattivato e infettato per contatto con ceppo ADV75D9; prelevato 5gg pc Siero : suino infettato sperimentalmente per via endonasale con ceppo ADV75D9; prelevato 0gg pi Siero : suino vaccinato volta e infettato dopo 30gg con il ceppo 5504/BS/05; prelevato 4gg pi Siero 3: suino vaccinato volta e infettato dopo 30gg con il ceppo 5504/BS/05; prelevato 4gg pi Siero 4: suino infettato per via endonasale con il ceppo ADV75D9 e prelevato gg pi Siero 5: suino infettato per via endonasale con il ceppo ADV75D9 e prelevato 3gg pi Siero 6: suino infettato per via endonasale con il ceppo ADV75D9 e prelevato 5gg pi Siero 7: suino infettato per via endonasale con il ceppo ADV75D9 e prelevato 9gg pi Siero 8: suino infettato per via endonasale con il ceppo ADV75D9 e prelevato 0gg pi Siero 9: suino infettato con ceppo Koynock e prelevato 7gg pi Siero 0: suino infettato con ceppo Koynok e prelevato 7gg pi. 3

4 Risultati attesi Tab.: Sieri utilizzati nel pannello e risultato atteso in ELISA ge e gb Identificazione siero ELISA ge ELISA gb NEG NEG NEG NEG 3 POS POS 4 NEG POS 5 NEG POS 6 NEG POS 7 NEG POS 8 NEG POS 9 POS POS 0 POS POS POS POS POS POS 3 POS POS 4 POS POS 5 POS POS 6 POS POS 7 POS POS 8 POS POS 9 POS POS 0 POS POS Kit ELISA utilizzati dai laboratori partecipanti L analisi ELISA ge è stata eseguita da tutti i laboratori aderenti al circuito, mentre l analisi ELISA gb è stata eseguita da 6 laboratori. Sono stati utilizzati diversi kit ELISA e/o diversi lotti dello stesso kit. Nello specifico, per quanto riguarda i diversi kit sono stati utilizzati: - PRV ge, kit IZSLER Brescia (6 laboratori); - ID Screen Aujeszky anti-ge competition ID VET (8 laboratori); - Herdcheck anti-prv gpi Test Kit, IDEXX ( laboratori); - PRV gb, kit IZSLER Brescia (6 laboratori); - ID Screen Aujeszky anti-gb competition ID VET ( laboratorio); - Herdcheck PRV gb Test Kit, IDEXX (8 laboratori). 4

5 Analisi statistica Il report è pensato per dare ai partecipanti la possibilità di confrontare i propri risultati con quelli degli altri laboratori. Il grado di concordanza tra laboratori è stato valutato mediante l indice kappa di concordanza per ciascuno dei due test effettuati, ricerca di anticorpi gb e ricerca di anticorpi ge per l intero gruppo di laboratori e per ciascuna categoria di assegnazione. La statistica Kappa proposta da Fleiss (97), costituisce uno degli strumenti più utilizzati, per saggiare l accordo tra più esaminatori. Al fine di valutare l accordo tra le classificazioni espresse tra diversi esaminatori (nel caso in studio, i diversi laboratori), si considerano N soggetti ciascuno dei quali viene classificato sulla base delle M categorie esaustive e mutuamente esclusive da un gruppo di n esaminatori, i cui membri non sono necessariamente gli stessi per ogni soggetto. Nel caso in analisi, i laboratori sono gli stessi per ogni soggetto (siero). Ciascun laboratorio ha valutato tutti i sieri. Indicato con x il numero di laboratori che hanno assegnato all i-esimo soggetto (i =,,,N) alla j-esima categoria (j =,,,M), le assegnazioni effettuate possono essere rappresentate come nella seguente tabella: Tab.3 Si noti che nella tabella ciascuna marginale x i. = M j= x = n è pari al numero di esaminatori per soggetto, mentre la generica marginale x = N. j x i= è pari al numero totale di assegnazioni per la categoria j. Definita la proporzione delle coppie di esaminatori che hanno assegnato il soggetto i alla categoria j P x x = = n n ( x ) ( n ) 5

6 è possibile calcolare la proporzione delle coppie di assegnazioni concordanti relative al soggetto i M M P = = i P x j= n n j= e misurare l accordo tramite la media N P= P = i x N i= n Nn i, j () (Fleiss, 97) Se si ammette che la proporzione p j x. j = = Nn Nn N i= x sia una stima della probabilità dell assegnazione casuale alla categoria j, allora, seguendo Scott (955) e Fleiss (97), l accordo atteso per effetto del caso è dato da M Pe = p j j= () Sottraendo l accordo osservato () con l accordo atteso () e normalizzando si ottiene la statistica K di Fleiss (97) P Pe K = (3) Pe che rappresenta una generalizzazione della kappa di Cohen (960). Gli intervalli di confidenza a livello di significatività α = 0,05 sono stati calcolati basandosi sull approssimazione Normale K ± zα/ se ( K) dove per il calcolo dello standard error è possibile usare la formula (Fleiss, 980) se ( K) = Nn ( n ) in quanto tutti gli esaminatori hanno esaminato tutti i soggetti. Nel caso in studio, tutti i laboratori hanno effettuato le analisi per tutti i sieri. D altro canto i laboratori che non hanno effettuato le analisi, non hanno analizzato nessun siero. 6

7 Risultati e analisi statistica In base ai valori di cut-off indicati dalle diverse ditte produttrici, i risultati ottenuti dai laboratori partecipanti, sono stati espressi in senso qualitativo, ovvero come Positivo, Negativo e, se previsto, Dubbio (Tab. 4; 5). Nelle tabelle non vengono riportati i laboratori che non hanno eseguito il test ELISA ge o gb, rispettivamente. Nel caso del test ELISA ge il laboratorio 4 ha effettuato due analisi con due kit differenti ( e ); pertanto, dato che il laboratorio 4 ha effettuate due analisi per ciascun siero, è possibile ritenere che il numero di esaminatori sia uno in più rispetto al numero di laboratori. Per poter paragonare i dati ottenuti al fine di calcolare l indice K, l espressione Dubbio è stata accettata come conforme al risultato atteso. Questo anche in considerazione del fatto che di norma un esito dubbio prevede il ri-prelievo del campione. Tab.4: Risultati relativi al test ELISA ge suddivisi per laboratorio LABORATORIO SIERO STATUS 3 4* NEG N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N NEG N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 3 POS P P N P P P P P P P P P P P P D P P D P P P P P P 4 NEG N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 5 NEG N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 6 NEG N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 7 NEG N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 8 NEG N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 9 POS P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P 0 POS P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P POS P P P P P P D P P P P P P P P D P P P P P P P P P POS P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P 3 POS P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P 4 POS P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P 5 POS P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P 6 POS P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P 7 POS P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P 8 POS P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P 9 POS P P P P P P P P P P P P P P P P D P P P P P P P P 0 POS P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P KIT LEGENDA KIT: : PRV ge, kit IZSLER Brescia; : ID Screen Aujeszky anti-ge competition ID VET; 3: Herdcheck anti-prv gpi Test Kit, IDEXX. * per il laboratorio 4 si riportano i risultati ottenuti sia con il kit che con il kit. 7

8 Tab.5: Risultati relativi al test ELISA gb suddivisi per laboratorio SIERO STATUS LABORATORIO NEG N N N N N N N N N N N N N N N N NEG N N N N N N N N N N N N N N N N 3 POS P P P P P P P D P P P P P P P P 4 POS P P P P P P P P P P P P P P P P 5 POS P P P P P P P P P P P P P P P P 6 POS P P P P P P P P P P P P P P P P 7 POS P P P P P P P P P P P P P P P P 8 POS P P P P P P P P P P P P P P P P 9 POS P P P P P P P P P P P P P P P P 0 POS P P P P P P P P P P P P P P P P POS P P P P P P P P P P P P P P P P POS P P P P P P P P P P P P P P P P 3 POS P P P P P P P P P P P P P P P P 4 POS P P P P P P P P P P P P P P P P 5 POS P P P P P P P P P P P P P P P P 6 POS P P P P P P P P P P P P P P P P 7 POS P P P P P P P P P P P P P P P P 8 POS P P P P P P P P P P P P P P P P 9 POS P P P P P P P P P P P P P P P P 0 POS P P P P P P P D P P P P P P P P KIT LEGENDA KIT: :PRV gb, kit IZSLER Brescia; : ID Screen Aujeszky anti-gb competition ID VET; 3: Herdcheck PRV gb Test Kit, IDEXX I risultati della statistica K di Fleiss sono per il test ELISA ge e gb pari rispettivamente a K= 0,99 (0,95;) e K = (0,960;), come riportato in tabella 6 e 7. Tab.6: test ELISA ge Siero Atteso Esito Negativo Positivo Totale Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo

9 4 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Totale K = 0,99 (0,95;) Tab.7: ELISA gb Siero Atteso Esito Totale Negativo Positivo Negativo Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Totale K = (0,960;) Per l interpretazione del valore di Kappa si è fatto riferimento alla tabella di Landis e Koch: Tab.8: concordanza dei risultati in relazione all indice K Kappa valutazione < 0 Nessun accordo Accordo lieve Accordo discreto Accordo moderato Accordo sostanziale Accordo pressochè perfetto I valori di kappa calcolati sia per il test Elisa ge che gb evidenziano un livello di accordo pressoché perfetto che, d altra parte, si evince chiaramente anche dalla rapida lettura dei dati stessi. 9