VALUTAZIONE DI SISTEMI OTTICI PER LA DIAGNOSI DI PERONOSPORA SU PIANTE DI VITIS VINIFERA L.

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1 Convegno di Medio Termine dell Associazione Italiana di Ingegneria Agraria Belgirate, settembre 2011 memoria n. VALUTAZIONE DI SISTEMI OTTICI PER LA DIAGNOSI DI PERONOSPORA SU PIANTE DI VITIS VINIFERA L. A. Calcante 1, A. Mena 1, F. Mazzetto 2 (1) Dipartimento di Ingegneria Agraria, Università degli Studi di Milano (2) Facoltà di Scienze e Tecnologie, Libera Università di Bolzano SOMMARIO Il presente lavoro considera il possibile utilizzo di dispositivi proximal sensing per la diagnosi in vigneto; in particolare, l obiettivo è la valutazione di due dispositivi ottici commerciali, il GreenSeeker e il CropCircle, nell evidenziare diversi livelli di sintomatologia di peronospora della vite, in confronto a uno spettrofotometro Vis/NIR impiegato come riferimento. A tal fine, sono state prelevate foglie di Vitis vinifera L. da piante precedentemente inoculate con Plasmopara viticola. Le foglie sono state suddivise in gruppi omogenei in base al livello di infezione per l esecuzione di misure statiche eseguite attraverso i dispositivi ottici. I dati mostrano una relazione lineare tra la percentuale di superficie fogliare sintomatica e NDVI (GreenSeeker: R 2 = 0.708; CropCircle: R 2 = 0.599; spettrofotometro Vis/NIR: R 2 = 0.995). L indice NDVI ottenuto dal GreenSeeker e dallo spettrofotometro inizia a ridursi sensibilmente in corrispondenza di foglie con superficie sintomatica pari al 10-20%. Inoltre, l analisi di regressione condotta sui dati misurati dal GreenSeeker appare più significativa rispetto al CropCircle. I risultati sembrano suggerire una maggiore capacità del GreenSeeker nell identificare i diversi livelli di malattia e il suo possibile uso in applicazioni di diagnosi in vigneto. Parole chiave: sensori ottici, viticoltura di precisione, diagnosi. 1 INTRODUZIONE Come è noto, la Viticoltura di Precisione (VP) è l insieme delle metodologie che consentono il monitoraggio e la gestione sitospecifica del vigneto; essa comprende aspetti di monitoraggio e gestione della variabilità spaziale all interno dei singoli vigneti, in termini di quantità e di qualità della produzione (Lamb & Bramley, 2001). Attualmente, la VP attribuisce molta importanza al monitoraggio colturale, cioè alla raccolta di informazioni attraverso osservazioni svolte direttamente in campo sulle colture riguardo stadi fenologici, stato nutrizionale e fitosanitario, attese produttive, ecc. In particolare, la diagnosi di diversi tipi di stress delle colture, che includono una serie di fattori limitanti la produttività, sta assumendo sempre maggiore importanza nella VP, soprattutto in relazione alle strategie di Integrated Pest Management. A tale scopo sono stati condotti studi su diverse colture relativi all identificazione di stress biotici e abiotici (Smith et al., 2005) o alla distinzione tra foglie sane e malate di una medesima

2 A. Calcante, A. Mena, F. Mazzetto coltura (Huang et al., 2007). Infatti, stati alterati delle piante influenzano le caratteristiche spettrali dei tessuti vegetali nelle bande del visibile (Vis) e dell infrarosso vicino (NIR), portando ad una variazione in termini di riflettanza dei tessuti stessi che può essere impiegata ai fini di una diagnosi dei sintomi (Naidu et al., 2009). Sebbene il Remote Sensing (RS) sia stato utilizzato per identificare parti di vigneto affette da malattia o con primi segni di stress (Lang et al., 2000), il suo impiego è complesso sia per l influenza delle condizioni climatiche sia per la difficoltà di gestione ed elaborazione dei dati. Pertanto, il presente lavoro considera il possibile uso di tecnologie proximal sensing da applicare direttamente in campo; in particolare, esso si pone l obiettivo di valutare due dispositivi ottici commerciali il GreenSeeker e il CropCircle nell evidenziare diversi livelli di sintomatologia di peronospora della vite, in confronto a uno spettrofotometro Vis/NIR impiegato come riferimento. 2 MATERIALI E METODI Plasmopara viticola (Berk. et Curt.) Berl. e De Toni è l agente eziologico della peronospora della vite, che rappresenta una delle più gravi malattie di Vitis vinifera L., ed è in grado di infettare foglie, grappoli e germogli erbacei, provocando la comparsa sulle prime della tipica macchia d olio di colore giallo pallido, e di necrosi estese sui grappoli. Le macchie presenti sulla superficie fogliare possono necrotizzare portando alla prematura defogliazione delle piante, soprattutto nei casi più gravi di infezione. Poiché i sintomi macroscopici della peronospora risultano particolarmente evidenti, l induzione di tale malattia nelle piante campione ha consentito una significativa valutazione della sensibilità dei dispositivi ai diversi gradi di severità della malattia. Nella presente ricerca, foglie di V. vinifera cv Cabernet Franc sono state prelevate da piante precedentemente inoculate con P. viticola, e classificate secondo una scala di malattia normalmente impiegata per la valutazione visiva della malattia in vigneto (Townsend & Heuberger, 1943). La scala è compresa tra un minimo di 0, corrispondente a foglia sana, e un massimo di 7, per foglie con superficie sintomatica pari al %, in funzione dell estensione dei sintomi di peronospora (Figura 1). Figura 1. Rappresentazione schematica dell allestimento del pannello.

3 Valutazione di sistemi ottici per la diagnosi di peronospora su piante di Vitis vinifera L. Le medesime foglie sono state suddivise in gruppi omogenei in base al livello di malattia e fissate su un pannello nero di materiale plastico per l esecuzione di misure statiche attraverso i dispositivi ottici. Le foglie sono state analizzate nella banda spettrale del Vis/NIR ( nm) attraverso uno spettrofotometro portatile andando ad indagare 20 punti per ciascun gruppo a diverso livello di infezione; ciò al fine di includere nell analisi sia tessuto sintomatico che sano. Il dispositivo è in grado di effettuare misure di riflettanza in seguito all illuminazione dei campioni con una fonte luminosa interna; la luce riflessa è quindi misurata da uno spettrofotometro e memorizzata grazie ad un software di acquisizione. Il sistema è composto da 5 elementi: 1) un sistema di illuminazione (luce alogena spot da 50 W, temperatura di 4500 K e picco di emissione a 500 nm); 2) una sonda a fibre ottiche tipo step index (mod. FCR- 19IR200-2-ME-S1, Avantes ); 3) uno spettrofotometro portatile tipo AvaSpec-2048 (Avantes ); 4) un PC per il controllo dell acquisizione dei dati; 5) una batteria da 12 V di alimentazione del sistema (Guidetti et al., 2010). Il GreenSeeker RT100 (Ntech Industries, Inc. Ukiah, California) e il CropCircle (Holland Scientific Inc., Lincoln, NE) sono due dispositivi ottici commerciali normalmente impiegati per il monitoraggio proximal sensing di colture di pieno campo, al fine della gestione della fertilizzazione azotata secondo i principi della Variable Rate Application (VRA). La loro applicazione in attività di monitoraggio del vigore vegetativo in vigneto è stata proposta da Drissi et al. (2009) e Mazzetto et al. (2010). Entrambe i dispositivi hanno una fonte luminosa interna di tipo attivo (LED, Light Emitting Diode), che emette luce pulsata nella banda del rosso e del NIR, e misurano la frazione di luce emessa dalla vegetazione (riflettanza) nella porzione indagata. I valori di riflettanza vengono utilizzati per il calcolo in tempo reale dell indice NDVI, secondo la formula (Rouse et al., 1974): (1) Il GreenSeeker è dotato di due LED che emettono luce pulsata nel Rosso a 660 ± 10 nm FWHM e nel NIR a 770 ± 15 nm FWHM, e restituisce valori di NDVI con una frequenza di 10 Hz. Il CropCircle è provvisto di un LED policromatico con picco di emissione a 650 nm (rosso) e a 880 nm (NIR), e di una coppia di fotodiodi che catturano selettivamente la radiazione visibile (<700 nm) e infrarossa (>800 nm). La frequenza di acquisizione del NDVI può essere impostata tra 1 e 20 Hz. Con GreenSeeker e CropCircle sono state svolte su ogni gruppo di foglie 3 letture statiche (tempo di acquisizione = 5 s). Ciascun dispositivo è stato alternativamente montato su un supporto metallico a una distanza ottimale di 0.60 m dalle foglie. A tale distanza il GreenSeeker emette una lama di luce di circa 0.7x0.01 m, mentre il CropCircle emette 15 spot luminosi che coprono una superficie di circa 0.4x0.15 m. I dati raccolti mediante lo spettrofotometro sono stati utilizzati per verificare se NDVI è adatto per il riconoscimento del livello sintomatico del tessuto fogliare secondo le 8 classi di malattia. Infatti, è possibile estrapolare dai dati di riflettanza da esso acquisiti le medesime porzioni dello spettro indagate da GreenSeeker e CropCircle, andando così a verificare quale dei due indici NDVI appare maggiormente sensibile ai livelli di infezione identificati. Successivamente, i due dispositivi sono stati testati sullo stesso materiale vegetale con l obbiettivo di verificare la loro reale capacità nell individuare i vari gradi di malattia.

4 A. Calcante, A. Mena, F. Mazzetto 3 RISULTATI E DISCUSSIONE I dati raccolti dallo spettrofotometro sono stati inizialmente analizzati attraverso il software The Unscrambler (versione 9.6, CAMO ASA, Norway) al fine di produrre e visualizzare gli spettri acquisiti (Figura 2). Figura 2. Spettri delle foglie suddivise in classi omogenee di malattia. Le linee tratteggiate evidenziano le bande dello spettro indagate dal GreenSeeker (A e B) e dal CropCircle (A e C). Ogni spettro è stato ottenuto come media delle acquisizioni effettuate nei 20 punti individuati in ciascuna classe. Le linee tratteggiate evidenziano le lunghezze d onda nel rosso (A) e nel NIR (B e C) utilizzate per il calcolo del NDVI, in modo da ottenere i medesimi indici restituiti dal GreenSeeker (A e B) e dal CropCircle (A e C). Nel grafico si può osservare come gli spettri assumano l andamento tipico del tessuto vegetale, caratterizzato da una maggiore riflettanza nel NIR rispetto al Vis, e da un picco nel verde (a circa 550 nm) e nel NIR (a circa 740 nm) oltre ad un minimo nella banda del rosso. Inoltre, gli spettri delle diverse classi si dispongono in ordine crescente in base all aumento di superficie sintomatica, mostrando una sempre maggiore riflettanza nel visibile e, al contrario, valori decrescenti nel NIR. Ciò conferma la perdita generale di funzionalità del tessuto vegetale caratterizzata dalla diminuzione della concentrazione di clorofilla e dalla senescenza precoce dei tessuti indotta dalla peronospora. Successivamente, i dati di riflettanza raccolti dallo spettrofotometro sono stati utilizzati per il calcolo di NDVI nella bande selezionate, così da ottenere un valore dell indice per ciascuna classe di malattia. Quindi, è stata condotta un analisi di regressione lineare (Figura 3), per indagare l esistenza di una possibile relazione tra la percentuale di superficie fogliare sintomatica media di ciascuna classe e i valori di NDVI. La regressione risulta significativa per l indice calcolato con le due diverse lunghezze d onda nel NIR (P < ***; R 2 = e R 2 = 0.946; RMSE = e RMSE = 0.058). Inoltre, si evidenza una certa variabilità del NDVI a partire dalla classe 4 che indica una diffusione dei sintomi su una superficie fogliare compresa tra il 10 e 20%.

5 Valutazione di sistemi ottici per la diagnosi di peronospora su piante di Vitis vinifera L. Figura 3. Regressione lineare tra la percentuale di superficie sintomatica e i valori di NDVI ottenuti dai dati raccolti dallo spettrofotometro utilizzando le medesime bande spettrali indagate da GreenSeeker (A) e da CropCircle (B). Per quanto riguarda i due dispositivi commerciali, dopo la verifica della ripetibilità delle misure (r = 0.999), è stata condotta un analisi di regressione lineare del tutto simile a quella eseguita per lo spettrofotometro considerando la media delle 3 misure eseguite con GreenSeeker (Figura 4A) e CropCircle (Figura 4B). La regressione è maggiormente significativa per il GreenSeeker (R 2 = 0.708; RMSE = 0.028) rispetto al CropCircle (R 2 = 0.599; RMSE = 0.058), inoltre quest ultimo restituisce valori di NDVI minori sebbene relativi alle stesse foglie indagate. Ciò è probabilmente dovuto alla diversa area di indagine dei 2 dispositivi, che nel caso del CropCircle garantisce una maggiore uniformità di campionamento, includendo in ogni misura non solo tessuto vegetale ma anche parti del pannello di sfondo la cui riflettanza va ad influire sul corrispondente valore di NDVI. Figura 4. Regressione lineare tra la percentuale di superficie sintomatica e i valori di NDVI ottenuti dai dati raccolti da GreenSeeker (A) e da CropCircle (B). Il confronto tra i risultati ottenuti a partire dai tre strumenti evidenzia come NDVI restituito dal GreenSeeker e dallo spettrofotometro decresca a partire da superficie sintomatica pari al 10-20%. Tuttavia, la regressione riferita a quest ultimo appare decisamente più significativa come indicato dall aumentato valore di R 2 (R 2 = per lo spettrofotometro e R 2 = per il GreenSeeker).

6 A. Calcante, A. Mena, F. Mazzetto 4 CONCLUSIONI Il presente lavoro considera il possibile uso di due dispositivi ottici commerciali, il GreenSeeker e il CropCircle, e di uno spettrofotometro portatile, usato come riferimento, nell identificare i diversi livelli di sintomatologia dovuta alla presenza di peronospora. L analisi di regressione eseguita sui valori di NDVI riferiti a foglie con crescente percentuale di superficie sintomatica, mostra una relazione decrescente tra le 2 variabili per tutti i dispositivi testati; confermando l effetto delle alterazioni fisiologiche del tessuto fogliare sulla variabilità dell indice NDVI. La regressione ottenuta per lo spettrofotometro è più significativa di quella riferita a GreenSeeker e CropCircle, per le sue caratteristiche ottimali e dell elevata risoluzione spettrale. Tra i due sistemi a luce pulsata, la regressione risulta maggiormente significativa per il GreenSeeker. Inoltre, i dati sperimentali mostrano un decremento significativo del NDVI per una percentuale di superficie sintomatica compresa tra il 10 e 20%, sia per il GreenSeeker che per lo spettrofotometro. Ciò sembra indicare una maggiore capacità del GreenSeekr nell identificare diversi livelli di malattia. Pertanto, i risultati sembrano confermare il possibile uso del GreenSeeker nella valutazione dell evoluzione temporale della crescita vegetativa delle coltura in applicazioni di diagnosi. BIBLIOGRAFIA Drissi, R., J. P. Goutouly, D. Forget e J. P. Gaudillère, Nondestructive measurement of grapevine leaf area by ground normalized difference vegetation index. Agronomy Journal [101], Guidetti, R., R. Beghi e L. Bodria, Evaluation of grape quality parameters by a simple Vis- NIR system. Transactions of the ASABE [53], Huang, W., D. W. Lamb, Z. Niu, Y. Zhang, L. Liu e J. Wang, Identification of yellow rust in wheat using in-situ spectral reflectance measurements and airborne hyperspectral imaging. Precision Agriculture [8], Lamb, D.W. & Bramley, R.G.V. Managing and monitoring spatial variability in vineyard productivity, Australian Grapegrower & Winemaker, 2001, 449a, Lang, N.S., Silbernagel, J., Perry, E.M., Smithyman, R., Mills, L. & Wample, R.L. Remote image and leaf reflectance analysis to evaluate the impact of environmental stress on grape canopy metabolism, HortTechnology, 2000, 10(3), Mazzetto, F., A. Calcante e A. Mena, Comparing commercial optical sensors for crop monitoring tasks in precision viticulture. Journal of Agricultural Engineering [1], Naidu, R.A., Perry, E.M., Pierce, F.J. & Mekuria, T. The potential of spectral reflectance technique for the detection of Grapevine leafroll-associated virus-3 in two red-berried wine grape cultivars, Computers and Electronics in Agriculture, 2009, doi: /j.compag Smith, K.L., Steven, M.D. & Colls, J.J. Plant spectral response to gas leaks and other stresses, International Journal of Remote Sensing, 2005, 26, Townsend, G.R. & Heuberger, I.W. Methods for estimating losses caused by disease in fungicide experiments, Plant Disease Reporter, 1943, 27(17),