ICSI Intra Cytoplasmatic Sperm Injection

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Gemma Alina Sasso
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1 TECNICA ICSI Laboratorio di Biologia della Riproduzione 1

2 ICSI Intra Cytoplasmatic Sperm Injection Recente procedura risalente agli inizi degli anni 90 che permette di iniettare con una micropipetta in vetro un singolo spermatozoo direttamente nel citoplasma ovocitario 2

3 ICSI Intra Cytoplasmatic Sperm Injection Alterazione ovocitaria Iniezione Aspirazione citoplasma PVP Alterazione spermatica PVP Aspirazione Fuoriuscita del citoplasma 3

4 ICSI Intra Cytoplasmatic Sperm Injection Preparazione campione seminale Decumulazione degli ovociti da pickup Preparazione piastra ICSI 4

5 ICSI Tecnica Pulizia degli ovociti 0,5 ml Terreno tamponato Azione chimica Azione meccanica 0,05 ml yase 80 UI 5

6 ICSI Sistema di micromanipolazione Microscopio invertito A 4x, 10x, 20x, 40x magnificatio Modulazione a contrasto di Hoffman Piastra termostatata Assicura un controllo della temperatura a 37 C Color video Permette ai visitatori di vedere la procedura di micromanipolazione 6

7 ICSI Sistema di micromanipolazione 1. Due manipolatori (uno per la holding, uno per la injection), per muovere le pipette nello spazio, sugli assi X,Y,Z; lo scopo è di posizionare rapidamente le micropipette prima di procedere ad una fine manipolazione. Il sistema di manipolazione può essere elettrico o idraulico 2. I micromanipolatori permettono di trasformare grandi movimenti in spostamenti fini per l iniezione della cellula. La micromanipolazione lungo gli assi X,Y è permessa muovendo il joystick in direzione orizzontale (destra o sinistra); lungo l asse Z (direzione verticale) muovendo l estremità del joystick 7

8 ICSI Sistema di micromanipolazione Aspirazione e Iniezione La pipetta holding e la injection sono fissate all estremità dell holder, connessa con i microiniettori riempiti di olio. Evitare la formazione di bolle I microaghi: in vetro; il diametro interno e quello esterno sono molto importanti per ridurre il danno ovocitario durante l iniezione 8

9 ICSI Sistema di micromanipolazione Microaghi Injection: 5 7 µm di diametro con o senza spike Holding: µm di diametro esterno e µm di diametro interno Entrambi gli aghi sono inclinati di per permettere un angolo di iniezione parallelo al piano di lavoro 9

10 ICSI Tecnica ICSI disco Petri Microgocce di terreno tamponato Le gocce sono coperte con olio minerale PVP 10

11 ICSI Tecnica PVP: facilita la manipolazione dello spermatozoo e permette un buon controllo dello stesso nella pipetta da injection Terreno tamponato: medium che riduce le variazioni di ph Olio minerale: previene l evaporazione del medium mantenendo una corretta osmolarità 11

12 ICSI Tecnica Immediatamente prima di eseguire l ICSI diluire 1 µl di sospensione spermatica nel PVP L ovocita è trasferito in una goccia di terreno tamponato Selezionare al microscopio un singolo spermatozoo con morfologia apparentemente normale 12

13 ICSI Tecnica Immobilizzazione Per eseguire l immobilizzazione, lo spermatozoo viene messo trasversalmente alla pipetta, quindi viene bloccato schiacciandolo sul fondo della piastra e attivato con dei movimenti lungo l asse L immobilizzazione dello spermatozoo è una tecnica importante nella procedura ICSI perché induce la permeabilizzazione della membrana spermatica, permettendo la successiva decondensazione nucleare necessaria alla fertilizzazione dell ovocita 13

14 ICSI Tecnica Aspirazion e Lo spermatozoo immobilizzato viene aspirato dalla coda nella pipetta injection che viene spostata nella goccia contenente l ovocita 14

15 ICSI Tecnica 15

16 Microiniezione intracitoplasmatica dello spermatozoo (ICSI) Quando viene consigliata? Infertilità maschile di grado severo Azoospermia ostruttiva e secretiva (spermatozoi testicolari o epididimali) Mancata o ridotta fertilizzazione in precedenti cicli di fertilizzazione in vitro (FIV) Ovociti scongelati Ridotto numero di ovociti Seme crioconservato in relazione alla qualità seminale successiva allo scongelamento 16

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