Microfertilizzazione assistita

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1 Università degli Studi di Bari Aldo Moro Microfertilizzazione assistita AA 2015/16 Corso di Biotecnologie riproduttive in animali in allevamento intensivo ICSI Micromanipolatore Dr Nicola Martino

2 Sommario (1) w Introduzione w Notizie storiche w Tecniche di perforazione della Zona Pellucida w Tecniche di introduzione artificiale del seme nell ovocita

3 Sommario (2) w Preparazione dell ovocita e del seme per l ICSI w Procedura di ICSI w ICSI in medicina riproduttiva w umana w ICSI in specie di interesse zootecnico w ICSI per la ricerca sul processo fecondativo

4 Notizie storiche w Keefer & Brackett, 1987 w Palermo et al., 1992 w Van Steirteghem et al., 1993

5 Stazione di micromanipolazione

6 Tecniche di perforazione della Zona Pellucida w ZD= zona drilling w ZT= zona thinning w PZD= partial zona dissection w PZR= partial zona removal

7 Tecniche di introduzione artificiale del seme nell ovocita w SUZI= subzonal sperm injection w ICSI= intracytoplasmic sperm injection

8 SCHEMA

9 Preparazione degli ovociti e degli spematozoi per l ICSI w Preparazione ovociti - rimozione cellule cumulo ooforo (80 UI/ml ialuronidasi in IVM medium) - selezione morfologica (PB, ZP, spazio perivitellino, citoplasma) w Preparazione spermatozoi - lavaggi (Tyr-HEPES; EBSS) - riduzione della motilità (+10% PVP)

10 Allestimento della piastra di ICSI Microgoccia di HTF con ovocita Microgoccia di EBSS 10% PVP con seme Piastra petri 60 mm Ø Striscia di seme per la messa a fuoco del fondo della piastra

11 Procedura di ICSI w Immobilizzazione ed aspirazione dello spermatozoo w Orientazione dell ovocita w Avvicinamento dello spermatozoo all estremità della pipetta di iniezione w Perforazione delle membrane ovocitarie w Aspirazione di parte del citoplasma della cellula uovo nella pipetta di iniezione w Rilascio dello spermatozoo nel citoplasma w Rilascio dell ovocita-passaggio nel mezzo di coltura

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13 Problemi w Eccessiva suzione di citoplasma w Eccessivo rilascio di medium w Difficoltosa perforazione membrane ovocita w Difficoltoso rilascio dello spermatozoo

14 ICSI in medicina riproduttiva umana ICSI con: Very Few Sperm Cells Sperm Head Immotile Sperm Dead Sperm Grossly Defective Sperm Cells Round/Elongated Spermatids

15 ICSI in specie di interesse zootecnico w Usata nelle specie nelle quali la fertilizzazione in vitro con tecnica convenzionale non consegue risultati buoni e riproducibili w Si può effettuare con spermatozoi presessati

16 ICSI per la ricerca sul processo fecondativo Sistema di utilità unica per indagini sulla sequenza di eventi di interazione tra ovocita e spermatozoo Microscopia CLSM

17 Tecnologie innovative w IMSI - Vantaggi: 6000x; anomalie - Svantaggi: Tempo 2 microscopi

18 Tecnologie innovative w IMSI Moltiplicando l ingrandimento dell obiettivo, quella del selettore, della telecamera e del monitor l ingrandimento finale. di 100 X 1.5 X 0.99 X (355.6MM X 8MM) = 6600 (Bartoov et al., 2002)

19 Tecnologie innovative w Birifrangenza

20 Tecnologie innovative

21 Tecnologie innovative

22 Tecnologie innovative w PIEZO-ICSI Vantaggi - Perforazione ovocita facilitata da micromovimenti controllati da sistemi piezo-elettrici = danni limitati - Evita suzione del citoplasma - Pipetta con estremità piatta

23 Tecnologie innovative w POLAR-SCOPE

24 Tecnologie innovative w Laser Assisted ICSI

25 ICSI con spermatozoi non maturi w ICSI con spermatozoi epididimali o testicolari prelevati chirurgicamente e crioconservati al momento di una biopsia per analisi istopatologiche

26 ROSI/ELSI w Definizione: Tecniche di fertilizzazione assistita in cui si utilizzano le cellule precursori delle cellule spermatiche mature ottenute da campioni eiaculati o da prelievo testicolare per la microiniezione diretta nell ovocita per il trattamento di infertilità maschile

27 Applicazioni w Coppie in cui il partner ha azoospermia non ostruttiva: la maturazione della cellula spermatica non si completa ma si arresta dopo il termine della meiosi

28 Riepilogo della spermatogenesi w La spermatogenesi può essere divisa in tre principali fasi: 1. Divisioni mitotiche degli spermatogoni fino alla formazione di spermatociti primari diploidi 2. Meiosi: 1) da spermatocita I a spermatocita II 2) da spermatocita II a spermatidio 3. Spermioistogenesi (RS ES Spz)

29 Struttura dell epitelio seminifero Spermatozoi Spermatidi Spermatociti Spermatogoni Sertoli users.unimi.it

30 Notizie storiche w 1995 Tesarik et al. w 1995 Fishel et al. w 1997 Antinori et al. w 1998 Khalili et al. Modelli sperimentali: topo, coniglio Nel topo si è ottenuta normale progenie usando RS di soggetti normali e infertili: nel topo gli eventi differenziativi post-meiotici non sono essenziali ai fini del normale sviluppo embrionale a termine

31 Classificazione degli spermatidi: w ROUND: (RS) Sa (RS) Sb (RS con piccolo flagello) w ELONGATED: (ES) Sc (ES con nucleo allungato) Sd1 (testa attaccata al midpiece) Sd2 (largo citoplasma residuo)

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33 Tecnica w Ovociti da IVM o COH come già detto; w Immediatamente dopo l aspirazione dell ovocita si effettua prelievo degli spermatidi con biopsia testicolare; campioni raccolti e processati in Ham s F10 con 10%SSS; slicing e vortex;fluido risultante lavato con centrifugazione 5 a 1000xg w Diametro delle micropipette: 5 µm per ELSI e 9 µm per ROSI; w Valutazione della fertilizzazione dopo h w Embryo grading e transfer

34 ROSI micropipets

35 Conventional ICSI micropipets

36 Risultati attuali più rilevanti w Gianaroli et al. Fertil Steril 1999; (human) w Shoisman et al. Curr Opin Urol 1999; 9: (human) w Tesarik et al. Fertil Steril 2000; 74: (human)

37 Limiti (1) w Difficoltà nella identificazione dei RS; miglioramenti con microscopia a contrasto di fase; uso di un colorante vitale fluorescente per i mitocondri; w Difficoltà a scegliere quelli più piccoli in numeri limitati: w Attivazione impropria dell ovocita da parte del RS un fattore presente nello spermatozoo maturo induce i flussi di Ca ++ nell ovocita che ne determinano l attivazione.

38 Limiti (2) w Deficienze nella maturazione di strutture essenziali per lo sviluppo embrionale (es: centrosoma) nel RS. w Stato fisiologico non ottimale del RS. w Incerte conseguenze sulla progenie. w Anomalie genetiche. w Limitati successi rispetto all ICSI.

39 Indagini molecolari w Hayashi et al. hanno usato Real Time RT- PCR per confrontare il pattern dei geni espressi in embrioni da ICSI e da ROSI: risultati similari (vedi fotocopia da BOR 2003). w Gli stessi autori hanno seguito il destino di un numero di trascritti di origine paterna (normalmente abbondanti e altamente stabili) dal momento della microiniezione fino alla loro scomparsa nell embrione precoce (vedi fotocopia da BOR 2003).

40 Indicazioni dei Comitati Scientifici w Le tecniche ROSI/ELSI non devono essere effettuate se dal soggetto si recuperano anche cellule spermatiche mature w I pazienti candidati per ROSI/ELSI devono ricevere un counselling pre-trattamento adeguato che li metta al corrente di tutti i potenziali rischi w L applicazione di ROSI/ELSI deve essere considerata sperimentale e pertanto richiede l approvazione e la supervisione da parte di un comitato istituzionale qualificato e costituito in modo adeguato

41 Bibliografia di riferimento w w w w w Choi et al. Effects of activation timing on the fertilization rate and early embryo development in porcine ROSI procedure. J Assist Reprod Genet. 2004; 21: Practice Committee and The Society for Assisted Reproductive Technology of the American Society for Reproductive Medicine. Round spermatid nucleus injection (ROSNI). Fertil Steril Sep;82 Suppl 1:S87-9. Khalili et al. Intracytoplasmic injection using spermatids and subsequent pregnancies: round (ROSI) versus elongated (ELSI) spermatids. J Assist Reprod Genet. 2002;19:84-6. Kishigami et al. Similar time restriction for ICSI and ROSI into activated oocytes for efficient offspring production. Biol Reprod. 2004;70: Epub 2004 Feb 25. Hayashi S et al. Mouse preimplantation embryos developed from oocytes injected with round spermatids or spermatozoa have similar but distinct patterns of early messenger RNA expression. Biol Reprod 2003; 69:

42 Letture consigliate w Transgenic Animal Technology (cap 20) w Dell Aquila et al., Hum Reprod 1997