A. O. MONALDI NAPOLI

Transcript

1 A DETERMINAZIONE DELLE RESISTENZE in Helicobacter pylori A. O. MONALDI NAPOLI U. O. C. BATTERIOLOGIA Direttore f.f. Dott.ssa Susanna Cuccurullo

2 LA DETERMINAZIONE DELLE RESISTENZE in H. pylori razionale Helicobacter pylori Helicobacter pylori non rappresenta un esempio paradigmatico di germe ad elevata attività di resistenza, tuttavia l argomento è fortemente pertinente al tema di questo convegno. Infatti, essendo percentualmente basso il tasso di isolamento in confronto alle diagnosi ed ai conseguenti trattamenti poliantibiotici empirici, il Laboratorio deve cogliere la opportunità di un approfondito studio della chemio-sensibilità dei ceppi disponibili, al fine della creazione di mappe epidemiologiche territoriali, più possibilmente circostritte, che guidino il trattamento empirico della maggior parte delle infezioni.

3 Antibiotico resistenza in Helicobacter pylori ; contenimento dei fallimenti terapeutici Contributo clinico: Propendere per metodiche colturali Prediligere terapie mirate Effettuare terapie empiriche ragionate ontributo laboratorio: Standardizzare le tecniche di isolamento ed identificazione Applicare le linee guida sulle tecniche di chemiosensibilità in vitro Raccogliere ed elaborare i dati per allestimento di mappe epidemiologiche

4 epidemiologia Infezione ubiquitaria acquisita in età pediatrica mediante trasmissione interumana diretta feco-orale e forse oro-orale Prevalenza: Incidenza: fino a 40% in bambini e 90% in adulti, in aree sottosviluppate 10-15% sotto i 15 anni, altrove. Aumenta con l età (effetto coorte) minore nella razza bianca ceppo prevalente CagA 1-8% annua inferiore a 1% in adulti siero

5 aspetti clinici Isolato da Marshall e Warren nel 1982 quale colonizzatore stabile della mucosa gastro-duodenale in soggetti con gastrite La discrepanza tra colonizzazione (prevalenza) ed infezione (incidenza) dimostra la variabilità patogenetica dei ceppi e la multifattorialità delle patologie correlate Gastrite cronica aspecifica Ulcera peptica duodenale Ulcera peptica gastrica Dispepsia funzionale, reflusso gastro-esofageo Cancro gastrico Linfoma gastrico Malattie extra-gastriche

6 meccanismi patogenetici Determinano la sopravvivenza, l attacco, la colonizzazione della mucosa gastro-duodenale e le conseguenti lesioni Attività ureasica: neutralizzazione ac.cloridrico e istioloisi da ammonio Attività muco e proteolitica: proteasi, fosfolipasi Penetrazione e adesione: forma e motilità, adesine Attività antibattericida: catalasi, superossido-dismutasi Attività citotossica: vacuolizzante (Vac A) e citoletale (Cag A)

7 caratteristiche morfologiche e colturali Gram negativo 2-5µ per 0,5-1µ ricurvo o spiraliforme o coccoide mobile per flagelli unipolari Ureasi-ossidasi-catalasi positivo microaerofilo, esigente, cresce in 3-7 giorni. Le forme coccoidi, quiescenti o di resistenza, sono spesso non coltivabili

8 diagnostica di laboratorio Metodi non invasivi: Urea breath-test Sierologia Antigene fecale Metodi invasivi: Istologia Coltura Ureasi

9 Urea breath-test ilevazione nell aria espirata di CO2 marcata (C 14 oc 13 ), dopo somministrazione orale di urea marcata Test rapido di alta specificità e sensibilità Consente la valutazione della eradicazione Non differenzia la localizzazione e la patologia Costoso

10 Sierologia Dosaggio di anticorpi specifici (ELISA) in siero, saliva, urina Test economico di alta sensibilità ma scarsa specificità Lenta negativizzazione dopo eradicazione Pratico per screening di massa

11 Antigene fecale Rilevazione diretta nelle feci di antigene di Hp, mediante test rapido immunoenzimatico (EIA) o in immunoprecipitazione su supporto solido Test rapido, sufficientemente economico, di buona sensibilità e specificità, segue l andamento clinico. Valida alternativa al breath-test in pazienti non collaboranti

12 diagnostica di laboratorio Metodi non invasivi: Urea breath-test Sierologia Antigene fecale Metodi invasivi: Istologia Coltura Ureasi

13

14 Test invasivi Necessitano di campioni biologici ottenuti mediante biopsie in corso di endoscopia gastro-duodenale. La distribuzione a patch per aree atrofiche o metaplasiche consiglia 2 prelievi antrali e 2 del fondo vantaggi: riconoscimento diretto e studio della chemiosensibilità svantaggi: Disagio, costo, necessità di prelievi multipli

15 Istologia L allestimento di preparati con diverse tecniche e con l utilizzo di colorazioni anche specifiche consente: la evidenziazione microscopica del microrganismo la precisazione della diagnosi (atrofia, gastrite attiva, metaplasia, displasia, etc)

16 Coltura rappresenta il gold standard diagnostico attraverso l isolamento consente la determinazione dello pettro di chemiosensibilità e la tipizzazione molecolare la sensibilità del metodo risente di numerose variabili: numero e sede di effettuazione dei campioni conservazione e trasporto esigenze nutrizionali e stato fisiologico del ceppo terreni, atmosfera e tempi di crescita pregressa assunzione di antimicrobici ed antiacidi

17 Coltura microaerofilia C 3-7 giorni Coltura non selettiva prelievo trasporto 0,5 ml Sol.Fis. x max. 3 h Portagerm pylori h T.A. Columbia agar 5% sangue animale Coltura selettiva Agar pylori (vanco + trimet + amph)

18 Identificazione

19 Esame diretto

20 Ureasi 1. Immergere un frammento bioptico in un mezzo liquido o semisolido contenente urea ed un indicatore 2. Osservare il viraggio di colore dovuto alla alcalinizzazione per idrolisi dell urea. Limiti del test: Falsi positivi per presenza di altri batteri ureasi produttori Falsi negativi per: bassa carica batterica interferenza da sangue e farmaci antisecretori presenza di antibiotici

21 chemiosensibilità Agar diluizione (NCCLS) Diffusione con disco (Mc Nulty) Diffusione con E-test (BSAC) Tecniche molecolari

22 Agar diluizione Medium: Inoculo: Mueller-Hinton agar 5%sangue montone (piastre di almeno 2 settimane) spots di 1-3 µl di sospensione salina 2.0 Mc Farland (1 x x 10 8 ) da piastra di agar sangue di 72 h Incubazione: 35 C x tre giorni in atmosfera microaerofila ottenuta con sistemi in uso per campylobacter Breakpoints: Claritromicina S 0,25 MIC (µg/ml) I 0,5 R 1 Performance standards for antimicrobial susceptibility testing Clinical and Laboratory Standards Institute / NCCLS M100-S15 Vol. 25 N. 1 January 2005

23 Diffusione con disco Medium: Inoculo: Mueller-Hinton agar o Columbia 5-10%sangue cavallo mediante tampone imbevuto in una sospensione 4.0 Mc Farland (1 x 10 8 ) da piastra di 4 giorni Incubazione: 35 C x tre-cinque giorni in atmosfera microaerofila Interpretazione: Metronidazolo Claritromicina Disco (µg) S I > qualunque R <16 no alone <18 Mc Nulty 2002

24 Diffusione con E-test Medium: Inoculo: Mueller-Hinton agar o Wilkins-Chalgren 5-10%sangue cavallo mediante tampone imbevuto in una sospensione in distillata 3.0 Mc Farland da piastra di h Incubazione: 35 C x tre-cinque giorni in atmosfera microaerofila MIC (µg/ml) Breakpoints: Amoxicillina Claritromicina Tetraciclina Metronidazolo S R BSAC Disc diffusion method for antimicrobial susceptibility testing Version August

25 EAS 013 GUIDA APPLICATIVA ETEST APPLICATION SHEET Helicobacter pylori Biolife Italiana Srl Doc. n M BE0461 IT, REV 01, 12/ Etest è un marchio registrato di AB BIODISK Terreno Mueller Hinton Blood Agar Sheep (cat. n ), (piastre con più di 2 settim. Altri terreni: Columbia blood agar (cat. n ), Iso-Sensitest blood agar Inoculo Sospensione delle colonie di 72 ore in brodo arricchito con siero, con torbidità pari a 3 Mc Farland. Applicazione Posizionare 1 striscia per piastra con la parte terminale (con la sigla) vicina al bordo piastra. Incubazione 35 C microaerofilia/72 ore (non superare questo tempo).

26 EAS 013 GUIDA APPLICATIVA ETEST APPLICATION SHEET Helicobacter pylori Biolife Italiana Srl Doc. n M BE0461 IT, REV 01, 12/ Etest è un marchio registrato di AB BIODISK MIC (µg/ml) * Amoxicillina 1 Claritromicina * Tetraciclina * Metronidazolo S ²1 ² 0,25 ²4 ²8 I - 0,5 - - R ³4 ³1 ³16 ³16 NCCLS M100-S14, 2004 Glupczynski et al. (1991). Evaluation of Etest for quantitative antimicrobial susceptibilty testing of H. pylori. JCM, 29, no. 9., Hirschl et al. (1993). Comparison of three methods for the determination of the sensitivity of H. pylori to metronidazole. JAC 32, Piccolomini et al. (1997). Comparative evaluation of Etest, agar dilution and broth dilution for testing susceptibilities of H. pylori strains to 20 antimicrobial agents. JCM 35,

27 Tecniche molecolari PCR, e real-time PCR Sequenziamento Ibridazione su solido (Lipa) antaggi: 1 ora, sia su ceppo isolato che su biopsia buona correlazione con tecniche tradizionali vantaggi: solo per claritromicina necessita di attrezzature ed esperienza

28