LE TECNICHE PER LO STUDIO DELLA CELLULA

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1 LE TECNICHE PER LO STUDIO DELLA CELLULA Potere risolutivo: minima distanza alla quale due punti possono essere distinti OCCHIO UMANO = 100 m (0,1 mm ) MICROSCOPIO OTTICO = 0,2 m MICROSCOPIO ELETTRONICO = 0,004 m (4 Å ) Microscopio ottico Microscopio elettronico Trasmissione Scansione

2 LE TECNICHE PER LO STUDIO DELLA CELLULA Microscopio ottico Microscopio elettronico Trasmissione Scansione

3 Vari tipi di microscopi mettono in evidenza le strutture a livello cellulare e subcellulare a seconda di come la cellula o i tessuti sono stati preparati Immagini : cellule epiteliali che rivestono l intestino tenue Microscopio elettronico a scansione (SEM) Cellule epiteliali di assorbimento Lamina basale Microscopio ottico a fluorescenza Microscopio elettronico a trasmissione (TEM) Membrana plasmatiche di cellule adiacenti Microvilli Lamina capillare basale

4 Preparato per microscopio ottico Campione incluso in paraffina Lama di metallo o di vetro Braccio del microtomo sezioni sottili campione su vetrino sezioni dello spessore di ca um Preparato per microscopio elettronico ultramicrotomo campione incluso in resina bacinella piena d acqua griglia di rame sezioni asciutte pronte per l osservazione griglia di rame sezioni dello spessore di ca. 0,1 um

5 Microscopia ottica utilizza la radiazione fotonica Oculare linea della visione Prisma riflettente Piano focale dell obiettivo Lenti obiettivo Campione su vetrino portaoggetti Lenti del condensatore Sorgente luminosa Dispositivo di arresto Del campo lella lampada immagine Lente obiettivo Campione Lente del condensatore

6 linea della visione Oculare Sorgente della luce incidente Filtri di barriera Specchio dicroico Filtro d eccitazione Lente dell obiettivo campione Fibre di actina colorate con un anticorpo fluorescente anti-actina in cellule in coltura Cellule di cute umana colorate per il DNA in blu e per il citoscheletro in verde

7 VARIE TECNICHE DI MICROSCOPIA OTTICA Microscopia in campo chiaro a contrasto a contrasto di fase Microscopia a fluorescenza confocale a campo chiaro su materiale fissato e colorato Microscopia a fluorescenza confocale

8 Microscopia elettronica impiega gli elettroni Filamento di tunsteno (catodo) Anodo Fascio d elettroni Obiettivo Condensatore Campione Obiettivo Elettromagnetico Proiettore Schermo (o lastra fotografica) I dispositivi elettronici impiegano elettromagneti per mettere a fuoco un pennello elettronico. In virtù della loro lunghezza d onda gli elettroni consentono una maggiore risoluzione rispetto al microscopio ottico.

9 Fotografie al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) Particelle d oro eletrondense Localizzazione di una proteina specifica mediante microscopia elettronica di campioni marcati con anticorpi Particelle di rotavirus

10 Fotografie al microscopio elettronico a scansione (SEM) SEM consente di osservare le superfici di campioni non sezionati. il campione viene fissato seccato e rivestito con un sottile strato di metallo. Un fascio di elettroni passa sopra il campione. Le molecole vengono eccitate e rilasciano elettroni secondari che vengono focalizzate su un rilevatore Tendine della spalla di un uomo. Lunghe fibrille di collagene L allineamento fianco a fianco delle molecole di collagene che costituiscono una fibrilla da luogo alla tipica serie di strisce parallele che si ripetono lungo ogni fibrilla.

11 Mitochondrial plasticy in skeletal muscle differentiation T=0 T=1 T=4 T=7 Barbieri et al., submitted

12 Fig 3 Mitochondrial plasticy in skeletal muscle differentiation Confocal microscopy of C2C12 myoblasts and late myotubes, after Mito Tracker and JC-1 staining E F Bar=20μm Barbieri et al., submitted Fluorescence JC-1 intensity in myoblasts (E) and late myotubes (F).

13 LA CELLULA EUCARIOTICA Membrana nucleare Membrana plasmatica Vescicole del Golgi Mitocondrio Perossiosomi Lisosomi Nucleo Reticolo endoplasmatico Vescicola secretoria Vescicole del Golgi Nucleo Lisosomi Mitocondrio Reticolo endoplasmatico Disegno di una cellula eucariotica e fotografia al microscopio elettronico di una plasmacellula, cellula del sangue che secerne anticorpi.

14 LA CELLULA ANIMALE - IL NUCLEO

15 IL NUCLEO Il nucleo è l organello piu grande nelle cellule eucariotiche ed è circondato da due membrane ognuna delle quali è un doppio strato fosfolipidico contenente molte proteine. In molti tipi cellulari la membrana nucleare esterna è continua con il reticolo endoplasmatico ruvido. Le due membrane nucleari sembrano fondersi a livello dei pori nucleari Nucleo Pori nucleari Preparazione ottenuta con la tecnica del congelamento-frattura da una cellula eucariotica, che mostra il nucleo e i pori nella membrana nucleare che attraversano le membrane nucleari interna ed esterna.

16 IL NUCLEO

17 Lamina nucleare

18 Il complesso del poro nucleare. L involucro nucleare dell ovocita di Xenopus visualizzato mediante microscopia elettronica. Questi pori di forma anulare contengono proteine di membrana specifiche e funzionano come canali che regolano il movimento di materiali tra il nucleo e il citosol.

19 IL NUCLEO Il nucleo è delimitato da un insieme di membrane doppio l involucro nucleare, che risulta interrotto dai pori nucleari La continuità delle cisterne perinucleari risultano garantite In determinati siti la membrana esterna dell involucro si estroflette verso il citoplasma per continuare nella membrana del reticolo endoplasmatico Nel nucleo il DNA è associato a molecole proteiche e forma un complesso filamentoso definito cromatina + Soluzione acquosa e le molecole presenti nucleoplasma La cromatina è connessa a una rete proteica tridimensionale : la lamina nucleare La cromatina tende a condensarsi e a elicarsi (avvolgersi ) con un passo strettissimo fino a formare per ogni specie un numero definito di cromosomi Nucleoli : contengono dal 10 al 20% dell RNA cellulare che partecipano nell assemblare le subunità ribosomiali da uno specifico RNA e particolari proteine.

20 La stragrande maggioranza del genoma eucariotico è contenuto nel nucleo Tuttavia una piccola, ma importante porzione è anche contenuta nei mitocondri e cloroplasti (piante) Il genoma batterico di Escherichia coli 1,5 mm Il genoma umano è lungo ca. 2 m (1,7m) Cromosoma E. coli Cromosoma cellule HeLa Cromosomi metafasici e compattamento della cromatina

21 STRUTTURA ED ORGANIZZAZIONE DEI CROMOSOMI Impaccamento del DNA nei cromosomi Il materiale costituente i cromosomi eucariotici viene chiamato cromatina : DNA complessato con proteine basiche, gli istoni, e proteine acide. Il compattamento del DNA cromosomico viene raggiunto complessandolo con con proteine che si legano al DNA. Prima unità d impaccamento : il nucleosoma costituito da un nucleo ottamerico discoidale di proteine istoniche H2A, H2 B, H3, H4 attorno al quale si avvolge una porzione di DNA di 146 pb. Ogni nucleosoma si associa con un istone H1 e la doppia elica di DNA si avvolge in una struttura a solenoide

22 Es. del cromosoma 17 umano. Dalla doppia elica del DNA al cromosoma metafasico

23 STRUTTURA ED ORGANIZZAZIONE DEI CROMOSOMI

24 Il DNA nucleare viene condensato nei cromosomi. Nel nucleo di una cellula che non si sta dividendo, i cromosomi sono dispersi e non abbastanza spessi da poter esser osservati al microscopio ottico. I cromosomi divengono visibili al microscopio ottico solo durante la divisione cellulare. Fotografie al microscopio ottico dei 46 cromosomi umani. Un individuo normale ha 23 paia di cromosomi un membro di ogni coppia è ereditato dalla madre e l altro membro dal padre.

25 LA CROMATINA Il DNA nucleare dei cromosomi costituisce la cromatina, che può presentarsi in due forme: 1. Eucromatina è la cromatina che si colora debolmente, si condensa durante la mitosi. Funzionalmente l'eucromatina è geneticamente attiva, vale a dire contiene geni che vengono trascritti in RNA. 2. Eterocromatina è la cromatina che si colora intensamente, questo avviene perchè la regione di cromatina implicata è più condensata dell eucromatina. L'eterocromatina è geneticamente inattiva, perché non contiene geni o perché i geni in essa contenuti non possono essere espressi. Esistono due classi di eterocromatina: - L'eterocromatina costitutiva è geneticamente inattiva, un esempio è rappresentato dell'eterocromatina dei centromeri e dei telomeri. - L'eterocromatina facoltativa è la cromatina che ha la potenzialità di condensarsi allo stato eterocromatico. L'eterocromatina è localizzata in uno strato subito al di sotto della membrana nucleare e attorno al nucleo

26 IL CICLO CELLULARE DELLE CELLULE EUCARIOTE La vita di una cellula comprende una breve fase di divisione M e un interfase di durata maggiore. Nelle cellule in grado di dividersi l interfase è a sua volta suddivisa in tre sottofasi : G1, S, G2

27 IL CICLO CELLULARE DELLE CELLULE EUCARIOTE Contenuto di DNA cromosomico umano durante il ciclo cellulare

28 Reticolo endoplasmatico (ER) RETICOLO ENDOPLASMATICO RUGOSO (RER) RETICOLO ENDOPLASMATICO LISCIO (SER) 0.5 um è costituito da una rete tridimensionale di elementi tubulari e cisterne appiattite. Il comparto interno è definito lume, separato dal citoplasma. Il sistema di membrane del reticolo endoplasmatico appare in continuità con l involucro nucleare Ad una parte della superficie esterna del reticolo aderiscono dei Ribosomi, che rappresentano la sede della sintesi delle proteine che verranno secrete nel citosol. Le proteine neo sintetizzate entreranno nel lume del reticolo sotto la direzione di una particolare sequenza di aa definita sequenza segnale. Funzione: Nel lume del RER le proteine subiscono delle modificazioni : Formazione ponti di solfuro Ripiegamenti Acquisizione di gruppi glicidici = glicoproteine

29 Reticolo Endoplasmatico Ruvido SEM X Reticolo endoplasmatico ruvido. I ribosomi appaiono sotto forma di sferule. Reticolo Endoplasmatico Ruvido TEM X Reticolo endoplasmatico ruvido di una cellula del pancreas. In basso un mitocondrio.

30 Reticolo endoplasmatico Le proteine che rimangono nel citosol o che vengono trasferite nei mitocondri o nei cloroplasti (piante) vengono sintetizzate sui ribosomi liberi. 1 Altre parti del reticolo endoplasmatico non sono associate a ribosomi; presentano forme caratteristiche a tubuli, a vescicole Per cui è definito liscio o SER da smoot Funzione: All interno del comparto del SER si svolgono processi biochimici che portano alle modifiche conformazionali delle molecole proteiche sintetizzate al livello del RER. Ruolo importante per il SER sta nella sintesi dei lipidi, e ormoni steroidei. 2