ISTOLOGIA e CITOLOGIA. F.Pagano

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1 ISTOLOGIA e CITOLOGIA

2 Organismo Apparato Organo Tessuto Cellula Molecola Atomo

3 Definizioni Citologia Studio della struttura della cellula e delle sue parti Istologia Studio dei tessuti

4 La sostanza vivente Proprietà della sostanza vivente: riproduzione, assimilazione, respirazione, accrescimento, sintesi, reattività agli stimoli, movimento. La sostanza vivente esiste a diversi livelli di organizzazione: VIRUS BATTERIOFAGI Cellule PROCARIOTE Cellule EUCARIOTE

5 Esempi di diversità morfologica tra i tipi cellulari che compongono un essere umano

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7 Ruoli della membrana plasmatica Mantiene l integrità strutturale della cellula Controlla le sostanze che penetrano ed escono dalla cellula Regola i rapporti cellula-cellula Riconosce mediante recettori antigeni, ormoni ed altri ligandi e permette una risposta cellulare a tali segnali che provengono dall esterno I lipidi di membrana sono i precursori di altre molecole lipidiche importanti per la fisiologia cellulare (ormoni steroidei, secondi messaggeri quali il diacil glicerolo, l acido fosfatidico, l inositolo trifosfato..)

8 Modello a mosaico fluido della membrana cellulare

9 Trasporto passivo

10 Trasporto attivo: la pompa sodio- potassio

11 Trasporto attivo secondario

12 Endocitosi ed esocitosi

13 Il reticolo endoplasmatico Reticolo endoplasmatico liscio (REL): sintesi steroidi trigliceridi e colesterolo detossificazione di materiali tossici quali alcool e barbiturici immagazzinamento di ioni calcio Reticolo endoplasmatico ruvido (RER): sintesi proteine (sulla superficie) modificazioni posttraduzionali delle proteine trasporto delle proteine in vescicole alla membrana plasmatica sintesi di fosfolipidilipidi e proteine integrali di membrana

14 Sintesi proteica sul reticolo endoplasmatico ruvido

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17 Il mitocondrio : la centrale energetica della cellula

18 Microfotografia elettronica di mitocondrio

19 Il citoscheletro

20 I microfilamenti di actina Fibrille contrattili (actina associata alla miosina) Reti gelificate (actina associata alla filamina) Fasci paralleli (actina associata alla fimbrina o alla villina)

21 Principali tipi di filamenti intermedi Cheratine (cellule epiteliali) Desmina (cellule muscolari) Vimentina cellule di origine mesenchimale) proteine dei neurofilamenti (neuroni) lamina nucleare (rivestimento interno della membrana nucleare di tutte le cellule)

22 I microtubuli

23 - Conferiscono rigidità e forma alla cellula - regolano il movimento di organelli e vescicole tramite motori molecolari (dineine( e chinesine) - costituiscono labase molecolare di ciglia e flagelli - sono necessari durante la mitosi

24 Eucromatina ed Eterocromatina

25 Nucleo Duplicazione del DNA Sintesi di RNA (mrna, trna, rrna)

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27 Sintesi di mrna e rrna

28 La cromatina

29 Quali sono gli strumenti a disposizione dell istologo per lo studio della cellula e dei tessuti?

30 Questione di dimensioni 1 mm Occhio umano Microscopio ottico Microscopio elettronico a scansione Microscopio elettronico a trasmissione 100 µm 10 µm 1 µm 100 nm 10 nm 1 nm 1 Å cell. epiteliali globuli rossi batteri virus proteine aminoacidi atomi

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32 Questione di dimensioni 1 mm Occhio umano Microscopio ottico Microscopio elettronico a scansione Microscopio elettronico a trasmissione 100 µm 10 µm 1 µm 100 nm 10 nm 1 nm 1 Å cell. epiteliali globuli rossi batteri virus proteine aminoacidi atomi

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34 Ciò si ottiene aumentando invece il potere di risoluzione

35 Si definisce potere di risoluzione la distanza minima che deve esserci tra due oggetti per essere visti come distinti Occhio: 0,1 mm Microscopio ottico: 0,25 micron Microscopio elettronico:0,5 nanometri il potere risolutivo di uno strumento (e non l ingrandimento) determina il massimo livello di dettaglio che si può ottenere nell immagine

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37 come si ottiene, a partire da tessuti biologici, una sezione da osservare al microscopio?

38 La preparazione di materiale istologico la luce del microscopio può attraversare solo materiale di spessore molto ridotto il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchiature, dette microtomi

39 La preparazione di materiale istologico la maggioranza dei tessuti biologici sono molli prima del taglio, il tessuto deve essere indurito Fissazione (es. con aldeidi) Inclusione In alternativa: congelamento

40 La preparazione di materiale istologico prima dell osservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica

41 sequenza dei passaggi in una tipica procedura istologica 1. fissazione di un campione di tessuto in formaldeide 2. Ovvero congelamento 3. inclusione del pezzo 4. taglio al microtomo 5. immersione in soluzioni di coloranti 6. montaggio su vetrino

42 Comuni colorazioni istologiche e reazioni REAGENTE RISULTATO Ematossilina Eosina Colorazione tricromica di Masson Orceina per le fibre elastiche Weigert per le fibre elastiche Argento Ematossilina ferrica Acido periodico-schiff Colorazioni di Giemsa e Wright Blu: nucleo, regioni acide del citoplasma, matrice cartilaginea Rosa: regioni basiche del citoplasma, fibre collagene Blu scuro nucleo; Rosso: muscoli, cheratine, citoplasma Blu chiaro: mucinogeno, collagene Marrone: fibre elastiche Blu: le fibre elastiche Nero: fibre reticolari Nero: striature muscolari, nucleo, eritrociti Magenta: glicogeno e molecole ricche di carboidrati Utilizzate per la colorazione differenziale delle cellule del sangue Rosa: eritrociti, granuli eosinofili Porpora: nuclei dei leucociti, granuli basofili Blu: citoplasma dei monociti e dei linfociti

43 tessuto epiteliale al microscopio ottico

44 cute

45 Attenzione alla sezione...

46 lo striscio di sangue Lo striscio,, una delle tecniche istologiche più diffuse, consente lo studio microscopico delle cellule del sangue e si distingue dal protocollo generico appena delineato perché,, ovviamente, non richiede il taglio del tessuto.

47 striscio

48 Citochimica e Istochimica L identificazione e/o la misura quantitativa mediante reazioni di colorazione specifiche (o mediante metodi fisici) di costituenti chimici delle cellule e dei tessuti.. (es( es. Acido periodico di Schiff, falloidina)

49 Altri microscopi A contrasto di fase Ad interferenza In campo oscuro A luce polarizzata A fluorescenza Confocale Elettronico a trasmissione a scansione

50 Microscopio a contrasto di fase

51 Microscopio a contrasto di fase Le cellule (sopra) sono quasi invisibili in campo chiaro, ma possono essere osservate chiaramente in contrasto di fase (sotto).

52 Microscopia in campo oscuro Strutture finissime non possono spesso essere viste se si trovano contro un fondo chiaro. Questa situazione cambia se le strutture vengono illuminate obliquamente di lato ed osservate contro un fondo possibilmente scuro.

53 Microscopia a luce polarizzata Immagini di capelli umani in luce normale (sinistra) e in luce polarizzata (destra). microscopio ottico composto utilizzabile per preparati il cui indice di rifrazione dipende dall orientamento della luce. Il campione viene illuminato con luce polarizzata; alcune zone del campione appariranno scure, altre colorate.

54 Microscopia a fluorescenza

55 Microscopia a fluorescenza Nella microscopia in fluorescenza i preparati vengono trattati con reagenti speciali, le cui singole molecole sono in grado di assorbire la luce per un tempo eccezionalmente breve - generalmente miliardesimi di secondo - e di emetterla poi nuovamente Le molecole fluorescenti possono assorbire solamente la luce di una certa lunghezza d'onda. Esempio di fluorescenza semplice: La marcatura rende visibili i nuclei cellulari ed in particolare i cromosomi

56 Immunofluorescenza e immunoistochimica Metodi altamente sensibili per la localizzazione di proteine o polisaccaridi nei tessuti IF: anticorpi coniugati con sostanze fluorescenti IIC: anticorpi coniugati con enzima perossidasi (rivelato poi da una reazione istochimica)

57 Metodo immunoistochimico diretto ed indiretto

58 Esempio di immunoistochimica diretta un gruppo di neuroni è decorato con anticorpi fluorescenti che riconoscono il recettore dell insulina

59 Immunofluorescenza indiretta

60 Microscopia Confocale Il microscopio confocale a scansione laser ha la possibilità di produrre sezioni ottiche anche dello spessore di 0.5 nm e di acquisirle direttamente per fare una ricostruzione 3D del preparato osservato. I dati acquisiti possono poi essere analizzati per determinare il volume, l'area e la morfologia del preparato o per osservarne la struttura da ogni punto dello spazio.

61 Microscopia Confocale

62 Microscopia Confocale

63 Microscopia Confocale Glomerulo olfattivo

64 il microscopio elettronico a trasmissione filamento (catodo) anodo condensatore preparato obiettivo proiettore schermo fluorescente B

65 Microscopia elettronica Preparazione del tessuto Fissazione in glutaraldeide Postfissazione in tetrossido di osmio Disidratazione con alcool Inclusione in plastiche acriliche o resine epossidiche Taglio all ultramicrotomo Sezioni di nm Aumento del contrasto Coloranti elettronici come acetato di uranile o citrato di piombo

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67 Esempio di microscopia elettronica a trasmissione Le immagini di microscopia elettronica sono in bianco e nero. Le parti scure si dicono elettrondense. L altissimo potere risolutivo del ME consente di distinguere numerose componenti subcellulari. linfocito

68 Microfotografia elettronica di RER

69 Microfotografia elettronica di Golgi + vescicole

70 Citochimica e congelamento- frattura

71 Microscopio elettronico a scansione Risoluzione piu bassa rispetto alla ME a trasmissione Consente di valutare il rilievo degli oggetti Usata per lo studio delle superfici cellulari

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73 Macrofago in microscopia elettronica a scansione

74 capello