-osservazione a fresco. -allestimento di preparati stabili

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Vittoria Fantoni
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1 Tecniche per l osservazione della materia vivente -osservazione a fresco insorgenza di fenomeni autolitici per liberazione di enzimi lisosomiali -allestimento di preparati stabili -fissazione -disidratazione -diafanizzazione -inclusione -taglio delle sezioni -sparaffinatura -colorazione -chiusura del vetrino (lutaggio)

2 Fissazione - stabilizzazione degli elementi tissutali - mantenimento dei rapporti topografici - blocco dei fenomeni putrefattivi - inibizione dei processi autolitici - conferimento di resistenza alle manipolazioni

3 se la fissazione chimica - determina la perdita di sostanze solubili (ad es. lipidi con etanolo) - determina la denaturazione di proteine e quindi la distruzione o inattivazione di enzimi - causa artefatti per diffusione o cambiamenti di volume tissutale fissazione fisica (congelamento rapido del tessuto) criostato

4 Processamento tissutale -disidratazione (bagni successivi di alcool a concentrazione crescente) alcool 70 alcool 80 alcool 85 alcool 95 -diafanizzazione (impregnazione con un solvente della paraffina) xilene toluene - benzene

5 -impregnazione con paraffina fusa miscela di idrocarburi saturi estratti dai residui di distillazione del petrolio -inclusione dei frammenti impregnati in blocchetti di paraffina

6 Taglio delle sezioni -microtomo a slitta (blocchetto fisso lama mobile) rotativo (blocchetto mobile lama fissa) microtomo rotativo microtomo a slitta -montaggio delle sezioni sul vetrino porta-oggetto

7 Sparaffinatura xilolo alcool 95 alcool 85 alcool 80 alcool 70 acqua Colorazione xilolo alcool 95 alcool 85 alcool 80 alcool 70 Montaggio -glicerina -resine naturali (Balsamo del Canadà) Lutaggio (copertura dei margini del copri-oggetto con una sostanza che solidifichi garantendo una perfetta tenuta)

8 Tecniche di colorazione istologica - sostanza colorante in grado di conferire colorazione ad altri corpi - colorante biologico rende visibile le strutture biologiche nei preparati istologici Sostanze cromogene auxocromi (acidità basicità) NH 2 (ammino) OH (ossidrile) COOH (carbossile) SH (sulfidrile) NOH (nitroso) ed altri.. cromofori -N N- (azo) C N- (immina) C O (carbonile) -C C- (acetilene) -C N- (nitrile) ed altri..

9 Colorazioni dirette indirette (tramite mordenzanti) colorante substrato non colorato colorante substrato colorato + mordenzante Colorazioni semplici ortocromatiche combinate metacromatiche (la struttura colorata assume una colorazione diversa rispetto al colorante di partenza)

10 Metacromasia cristal violetto, violetto di metile, rosso neutro, safranina, blu di toluidina, blu di metilene e altri. colorazione ortocromatica Polimero polianionico (cromotropo): mucopolisaccaridi solfati granuli dei mastociti colorazione metacromatica acido ialuronico cartilagine distanza 5-7 Å

11 Colorazione metacromatica di un mastocito nel tessuto connettivo

12 Coloranti naturali (ad es. ematossilina) artificiali Coloranti basici Coloranti acidi nucleari (ematossilina) citoplasmatici (eosina)

13 Colorazioni combinate (tricromiche) Colorazione di Van Gieson ematossilina fucsina acida acido picrico nuclei blu-neri tess. connettivo rosso tess. muscolare ed epiteliale giallo

14 Colorazione di Masson acido picrico fucsina acida verde luce nuclei viola tess. connettivo blu-verde tess. muscolare rosso

15 Colorazione di Mallory-Azan azocarminio azzurro di anilina orange G nuclei rossi tess. epiteliale e muscolare rosso tess. connettivo azzurrro

fissazione chimica taglio delle sezioni con il criostato -i mezzi di

16 Colorazione dei lipidi -i coloranti del gruppo Sudan sono lipofili (sudanofilia dei lipidi) -non devono essere utilizzate metodiche di fissazione chimica taglio delle sezioni con il criostato -i mezzi di montaggio devono essere idrosolubili colorazione con ematossilina-eosina colorazione con il Sudan IV

17 Colorazione PAS (periodic acid-schiff) fucsina basica + H 2 SO 4 PAS positivi: -glicogeno -mucopolisaccaridi neutri -mucoproteine -glicoproteine -glicolipidi

18 nuclei contro-colorati con Alcian Blue

19 Colorazione di Feulgen blanda idrolisi con HCl Reattivo di Schiff prodotto di addizione Feulgen positivo: DNA Feulgen negativo: RNA

20 Colorazione con arancio di acridina (fluorescente) -l arancio di acridina è un agente intercalante degli acidi nucleici -alla luce U.V. ( = 365 nm.) DNA giallo-verde RNA rosso linfociti plasmacellule

21 Immunoistochimica lamina basale in tessuto carcinomatoso (anti-collagene IV) recettore dell insulina in neuroni di ratto

22 Autoradiografia Incorporazione di prolina tritiata nella lamina basale

23 Ibridazione molecolare in situ nuclei contenenti il DNA del papillomavirus un linfocita T che esprime l RNA dell HIV-1

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