Technovit 9100 NEW. 8 bustine da 1 g di Induritore 1 10 ml di Induritore 2 5 ml di Regolatore di Polimerizzazione

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1 Technovit 9100 NEW Notizie generali La resina Technovit 9100 NEW è un sistema di polimerizzazione a base di metil metacrilato (MMA) sviluppato per l inclusione ed il taglio di tessuto non decalcificato o con impianti metallici. Codice Confezione 1 litro di soluzione base 120 g di polvere di PMMA bustine da 1 g di Induritore 1 10 ml di Induritore 2 5 ml di Regolatore di Polimerizzazione La validità del prodotto correttamente conservato è di anni 3. Produttore: Heraeus Kulzer GmbH & Co. KG - Wehrheim - Germania Distributore esclusivo per l Italia: Bio-Optica Milano S.p.A. Campi di applicazione Preparazione di sezioni sottili di preparati istologici contenenti calcificazioni, quali biopsie osteo-midollari. Tecniche di taglio ed abrasione (Contact Point Technique*) di osso compatto non decalcificato e con impianti metallici. Sezioni fini e semifini di tessuto molle su cui è possibile effettuare indagini di immunoistochimica. * Il sistema di taglio ed abrasione Contact Point Technique è un esclusiva Exakt Apparatebau. Caratteristiche tecniche La polimerizzazione chimica della resina Technovit 9100 NEW avviene in assenza di ossigeno, grazie alla presenza di un catalizzatore composto da un componente amminico e da un perossido. Data di revisione: 14 marzo 2008 Pagina 1 di 5

2 Componenti aggiuntivi, come la polvere di PMMA (polimetilmetacrilato) e il regolatore di polimerizzazione, consentono di ottenere una polimerizzazione controllata ad una temperatura compresa tra - 8 e - 20 C, garantendo la dispersione del calore prodotto durante la polimerizzazione. Il tempo di polimerizzazione varia tra le 18 e le 24 ore. Dopo il pretrattamento necessario del tessuto, l inclusione, il taglio e la rimozione del polimero MMA, possono essere effettuate tutte le metodiche di colorazione, da quelle classiche, fino all immunoistochimica e all ibridazione in situ (ISH). Descrizione dei componenti SOLUZIONE BASE La soluzione base è composta da molecole organiche, monomeriche, con almeno un doppio legame carboniocarbonio. Lo stabilizzante contenuto nel kit è responsabile della stabilità della resina durante lo stoccaggio. Le proprietà idrofile sono migliorate dall aggiunta di un agente speciale in grado di conferire idrofilia. La soluzione base della resina può essere utilizzata nella forma stabilizzata o in quella destabilizzata. L uso della forma destabilizzata garantisce di ottenere ottimi risultati, sovrapponibili a quelli che si ottengono con inclusioni in paraffina, applicando tutte le metodiche d immunoistochimica. Per una colorazione di routine, si può evitare di destabilizzare la resina. L uso della forma destabilizzata permette una polimerizzazione più rapida della resina. Per destabilizzare la soluzione base occorre riempire una colonna cromatografica per i suoi ¾ con ossido di alluminio (Al 2 O 3 ). Questa quantità consente di destabilizzare circa 3-4 litri di soluzione base. Versare la soluzione base nella colonna e attendere circa 1 ora per la fine del processo. La soluzione così destabilizzata potrà essere conservata a 4 C per una settimana o a - 20 C per due settimane in una bottiglia di vetro scuro. POLVERE DI PMMA La polvere di PMMA è formata da pellets di polimetilmetacrilato ed è usata per: ridurre gli effetti di restringimento del tessuto dovuti alla polimerizzazione; ridurre la quantità di calore generato durante il processo di polimerizzazione; migliorare la qualità del prodotto polimerizzato. INDURITORE 1 L induritore 1, in polvere, è uno dei componenti che consente l inizio del processo di polimerizzazione. E un derivato del perossido di benzoile che, in combinazione con l induritore 2, innesca, appunto, il processo di polimerizzazione. Data di revisione: 14 marzo 2008 Pagina 2 di 5

3 INDURITORE 2 Questo induritore liquido è il secondo componente del sistema d iniziazione. Esso lavora, in modo catalitico, sull induritore 1 per consentire una polimerizzazione controllata anche ad una temperatura di 0 C. REGOLATORE DI POLIMERIZZAZIONE Il regolatore è un composto organico che consente di controllare la polimerizzazione, senza un grande incremento di temperatura durante la reazione. Metodica di utilizzo Soluzione base (MMA) Polvere di PMMA Induritore 1 Induritore 2 Regolatore Stoccaggio Pre-infiltrazione 200 ml 1 g Infiltrazione Portare a 250 ml 20 g 1 g, 2 g (*) Soluzione stock A Portare a 500 ml 80 g 3 g, 4 g (*) Soluzione stock B Portare a 50 ml 4 ml 2 ml Una settimana a temp. ambiente Una settimana a 4 C Due settimane a 4-20 C Due settimane a 4-20 C * quantità nel caso in cui si utilizzi la resina base destabilizzata FISSAZIONE DEL TESSUTO Per una corretta fissazione del tessuto è generalmente necessario un tempo compreso tra le 12 e le 24 ore. Per la fissazione, possono essere utilizzate diverse soluzioni, a seconda del tipo di campione o di antigene/enzima che deve essere rivelato. Le seguenti metodiche di fissazione possono essere utilizzate anche quando è necessario rivelare un antigene o l attività di un enzima e quindi procedere con tecniche d immunoistochimica: 1. formalina 4% neutra tamponata; 2. formalina 10% tamponata; 3. soluzione all 1,4% di paraformaldeide a 4-8 C per ore, ideale per la rivelazione di enzimi come la fosfatasi alcalina o per antigeni sensibili che possono subire denaturazione o modifiche strutturali. DISIDRATAZIONE, PRE-INFILTRAZIONE E INFILTRAZIONE La disidratazione avviene utilizzando concentrazioni crescenti di etanolo e può essere effettuata in modo automatico con un processatore a temperatura ambiente. Come solvente intermedio, utilizzare xilene. La pre-infiltrazione e l infiltrazione avvengono in tre passaggi. I primi due passaggi della pre-infiltrazione possono essere effettuati automaticamente nel processatore. I tempi indicati nella tabella sottostante sono Data di revisione: 14 marzo 2008 Pagina 3 di 5

4 ottimali per biopsie osteo-midollari e biopsie pelviche (campioni di piccole dimensioni). Per campioni di tessuto di dimensioni maggiori, i tempi e i volumi aumentano proporzionalmente. PASSAGGIO SOLUZIONE TEMPERATURA TEMPO MINIMO Disidratazione 1 Etanolo 70% T ambiente 1 ora Disidratazione 2 Etanolo 80% T ambiente 1 ora Disidratazione 3 Etanolo 96% T ambiente 1 ora Disidratazione 4 Etanolo 100% T ambiente 1 ora Disidratazione 5 Etanolo 100% T ambiente 1 ora Disidratazione 6 Etanolo 100% T ambiente 1 ora Disidratazione 7 Etanolo 100% T ambiente 1 ora Intermedio 1 Xilene T ambiente 1 ora Intermedio 2 Xilene T ambiente 1 ora Pre-infiltrazione 1 Pre-infiltrazione 2 (ultimo passaggio effettuabile in automatico) Xilene/soluzione base stabilizzata Soluzione base stabilizzata (200 ml) + induritore 1 (1 bustina) T ambiente T ambiente 1 ora 1 ora Pre-infiltrazione 3 (a freddo) Soluzione base destabilizzata (200 ml) + induritore 1 4 C 1 ora Infiltrazione (a freddo) Soluzione base (250 ml) + 2 g di induritore g di polvere di PMMA 4 C Overnight (per campioni molto grandi anche alcuni giorni) PREPARAZIONE DELLA SOLUZIONE STOCK A Aggiungere 80 g di polvere di PMMA, in un cilindro graduato da 500 ml, a circa 400 ml di soluzione base (stabilizzata o destabilizzata). Mantenere la miscela in costante agitazione con un agitatore magnetico. Quando la soluzione diventa completamente trasparente (saranno necessarie circa 3 ore), aggiungere 3 g (o 4 g se la soluzione è stabilizzata) di induritore 1, mantenendo sempre in agitazione. Togliere, infine, l agitatore magnetico e portare a volume (500 ml) con la soluzione base. Trasferire la risultante soluzione stock A (caratterizzata dalla sua viscosità) in una bottiglia di vetro scuro con tappo a vite e conservarla ad una temperatura compresa tra 4 e - 20 C fino all utilizzo. PREPARAZIONE DELLA SOLUZIONE STOCK B Aggiungere, con una pipetta, 4 ml d induritore 2, in un cilindro graduato da 50 ml, a circa 30 ml di soluzione base (destabilizzata o stabilizzata). Mantenere la miscela in costante agitazione con un agitatore magnetico. Aggiungere poi, con una pipetta, 2 ml di regolatore di polimerizzazione e portare a volume (50 ml) con la soluzione base. Agitare vigorosamente la miscela risultante, che non deve essere viscosa, trasferirla in una bottiglia di vetro scuro con tappo a vite e conservarla ad una temperatura compresa tra 4 e - 20 C fino all utilizzo (a - 20 C può essere conservata per un periodo massimo di 2/3 mesi). Data di revisione: 14 marzo 2008 Pagina 4 di 5

5 PREPARAZIONE DELLA MISCELA DI POLIMERIZZAZIONE E INCLUSIONE Unire, in un beaker, appena prima dell utilizzo, le soluzioni Stock A e Stock B ancora fredde, aggiungendo a nove parti della soluzione Stock A, una parte di soluzione Stock B. Agitare la soluzione così prodotta (miscela di polimerizzazione) con una bacchetta di vetro. Posizionare i campioni nelle molds e coprirli completamente con la miscela di polimerizzazione. Mettere i campioni in frigo (circa 0-4 C), senza coperchio, producendo un vuoto parziale (utilizzando, per esempio, una pompa ad acqua, massimo 200 mbar) e lasciarli per circa 10 minuti. Dopodiché, aprire il vuoto, prelevare i campioni, chiuderli ermeticamente, assicurandosi che non ci sia aria all interno, e metterli in freezer (- 8/- 20 C) per circa 24 ore. Il processo di polimerizzazione avviene alla temperatura di - 8/- 20 C. Prima di estrarre e lasciare i campioni a temperatura ambiente, porli a circa 4-8 C (frigorifero) per circa 1 ora, per consentire al tessuto di adattarsi a temperature più alte senza rovinarsi. Esempi di tempi e temperature di polimerizzazione a seconda delle molds utilizzate: capsule di gelatina, circa 2 ml: 24 ore a - 2/- 4 C; molds di teflon, circa 3 ml: 24 ore a - 2/- 4 C; capsule in PVC, circa 15 ml: 24 ore a - 3/- 4 C; molds in PVC, circa ml: 24 ore a - 10/- 15 C. TAGLIO AL MICROTOMO Utilizzare un microtomo rotativo, dotato di lame di metallo duro di tipo D, di diamante o di vetro. Sgrossare i campioni, prima di tagliarli. Utilizzare etanolo 30% come fluido di taglio. Dopo averle tagliate, trasferire le sezioni su vetrini polilisinati o su vetrini Superfrost Plus, utilizzando etanolo 50% come fluido di montaggio, e coprirle con un foglietto di PVC. Rimuovere l eccesso di etanolo con carta da filtro e mettere i vetrini, coperti con il foglietto di PVC, in una pressa per consentire la completa adesione della fettina al vetrino. RIMOZIONE DELLA RESINA DALLE SEZIONI PRIMA DELLA COLORAZIONE Tutti i passaggi avvengono a temperatura ambiente. SOLVENTE Xilene 2-metossietilacetato (2-MEA) Acetone puro Acqua distillata TEMPO 2-3 immersioni di 20 minuti l una 20 minuti 2 immersioni da 5 minuti 2 lavaggi da 2 minuti Per informazioni relative ai rischi che presenta il preparato, misure precauzionali da adottare durante l uso e misure di primo soccorso è disponibile la relativa scheda di sicurezza. Data di revisione: 14 marzo 2008 Pagina 5 di 5