ESAME MORFOLOGICO DEL SANGUE

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1 ESAME MORFOLOGICO DEL SANGUE Obiettivo Con l esame morfologico del sangue si intende differenziare gli elementi figurati del sangue, tramite la colorazione di May Grunwald-Giemsa, per poterli riconoscere e contare. Evidenziare anche la presenza di eventuali cellule anomale. Materiale Vetrino porta-oggetti, Pipetta Pasteur, Vetrino molato, vaschetta per colorazione, microscopio ottico con obiettivo ad immersione OIL. Reagenti Miscela alcool etilico ed etere etilico al 50%, colorante di May Grunwald, colorante di Giemsa, acqua distillata. Principio del metodo Per poter effettuare un esame morfologico del sangue è necessario dover allestire uno striscio ematico su di un vetrino porta-oggetti. Fissare le cellule e colorarle con il metodo May Grunwald-Giemsa. In seguito si osserva il preparato al microscopio ottico e, seguendo una procedura di seguito illustrata, si contano le varie cellule bianche esprimendo il valore in percentuale (formula leucocitaria). I corpi figurati del sangue sono: le emazie, i globuli bianchi (suddivisi in granulociti e agranulociti in base alla presenza o meno nel citoplasma di granuli), piastrine ed eventuali cellule anomale. Tra gli agranulociti troviamo i Linfociti e i Monociti, mentre i granulociti si distinguono in: Neutrofili, Basofili ed Eosinofili. Questi ultimi si differenziano per il diverso colore che presentano i granuli citoplasmatici dopo la colorazione di May Grunwald-Giemsa.

2 Procedimento Preparazione di uno striscio Porre una goccia di sangue all estremità di un vetrino porta-oggetti, ben sgrassato, con una pipetta Pasteur cercando di evitare la formazione di bolle d aria; Utilizzando un vetrino con le estremità molate, distribuire la goccia lungo il margine interno del vetrino molato; Lasciar scorrere il vetrino molato lungo il vetrino porta-oggetti mantenendo una inclinazione di 45º ed una velocità costante; Asciugare all aria. Per ottenere un ottimo striscio sanguigno, il vetrino portaoggetti deve essere perfettamente pulito con un buon detergente e sgrassato con una miscela di etanolo ed etere etilico al 50%. E importante, inoltre che lo striscio non sia nè troppo spesso nè troppo sottile, poichè nel primo caso si avrebbe un ammassamento delle cellule ematiche che renderebbe impossibile l esame dei loro caratteri morfologici; nel secondo caso l elevata dispersione dei globuli bianchi causerebbe difficoltà per la determinazione della formula leucocitaria. Effettuata la preparazione dello striscio si passa alla colorazione di May Grunwald-Giemsa. Colorazione Il colorante di May Grunwald è una soluzione di eosina e blu di metilene in metanolo; il primo comporterà una colorazione rosa/rossa e il secondo comporterà una colorazione blu/viola. Il Giemsa invece è una miscela di due coloranti: eosina e blu

3 di metilene. La colorazione deve essere effettuata sotto cappa aspirante con carboni attivi Con una pipetta Pasteur coprire il vetrino con il primo colorante (May Grunwald) contandone le gocce e lasciare agire per 3 minuti; in questo fase avviene solo la fissazione delle cellule grazie alla presenza di metanolo nel reattivo; Senza togliere il primo colorante aggiungere tante gocce di acqua distillata quante ne sono state messe per il primo ottenendo così una diluizione del 50%, miscelare soffiando con la pipetta; in questa seconda fase avviene la colorazione grazie al fatto che l acqua ha permesso la dissociazione in ioni del colorante May Grunwald. Passati 3 minuti si scola, senza lavare, il colorante rimasto; Si ricopre il vetrino porta-oggetti con il secondo colorante (Giemsa) diluito con acqua distillata 1:10 e si attende 15 minuti; questo serve per la differenziazione delle cellule; Lavare con acqua e lasciare asciugare. Il vetrino così preparato potrà essere osservato al microscopio ottico con l obiettivo ad immersione. Come si presentano le cellule dopo la colorazione La colorazione si basa su che tipo di reazione, (acida o basica), avranno i vari costituenti cellulari nei confronti del coloranti usati. L eosina (acida), si fisserà sulle strutture basiche colorandosi in rosso/arancio, mentre le altre componenti acide fisseranno i prodotti di ossidazione del blu di metilene colorandosi in blu. Quindi, gli eritrociti si presenteranno con una colorazione viola chiaro. I granulociti neutrofili avranno il nucleo blu/viola e i granuli incolori, i basofili con i granuli blu tali da ricoprire quasi completamente il nucleo e gli

4 eosinofili con i granuli di colore rosso/arancio. Esame morfologico ( formula leucocitaria ) L osservazione dello striscio sanguigno colorato ci permette di determinare la formula leucocitaria, la forma dei globuli rossi e riconoscere eventuali cellule anomale. La formula leucocitaria consiste nel determinare la percentuale dei diversi tipi di globuli bianchi nel sangue e cioè: linfociti, monociti, granulociti neutrofili, basofili ed eosinofili. A tal scopo, si sposta il tavolino del microscopio, su cui è posizionato il vetrino porta-oggetti con lo striscio sanguigno colorato, in modo da seguire l andamento di una linea greca per osservare le varie zone del preparato. Lungo il cammino ottico, ogni volta che s incontra una cellula, si dovrà riconoscere a quale classe appartiene in base alla colorazione assunta e contarle fino ad un massimo di 100 cellule. Si annota, per evitare errori, con un sistema pratico consistente nel segnare punti e linee che, per ogni dieci elementi, si disegna un quadrato con due diagonali, come nell esempio: I valori normali sono i seguenti: Monociti 4-8 % Linfociti % Granulociti neutrofili % Granulociti eosinofili 2-5 % Granulociti basofili 1-2 %

5 ATTENZIONE: Il sangue umano non può essere utilizzato nei laboratori scolastici per motivi di rischi di contaminazione; al suo posto può essere impiegato sangue di montone testato e controllato dalle ditte venditrici per addestrarsi ad eseguire lo striscio sanguigno e la colorazione di May Grunwald-Giemsa. Per la lettura e la determinazione della formula leucocitaria si possono utilizzare vetrini di strisci di sangue già preparati e pronti all uso acquistati da ditte fornitrici specializzate in quanto il sangue di montone non presenta le caratteristiche cellulari simili a quelle del sangue umano. Si raccomanda, inoltre, di lavorare sempre sotto cappa aspirante a carboni attivi e di utilizzare i dispositivi di protezione individuale previsti dalla normativa vigente.