Parametri fondamentali della microscopia

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1 Parametri fondamentali della microscopia La proprietà fondamentale di un microscopio è la possibilità di ottenere un immagine ingrandita di un oggetto. L ingrandimento fornito da uno strumento ottico è definito come il rapporto tra: L angolo sotto cui si vede un oggetto con lo strumento e l angolo sotto cui si vede lo stesso oggetto senza strumento. Il rapporto tra la dimensione dell immagine vista al microscopio e quella dell oggetto

2 Parametri fondamentali della microscopia L ingrandimento da solo non basta, è necessaria la capacità di distinguere i particolari: risoluzione

3 Parametri fondamentali della microscopia Potere di risoluzione Il potere di risoluzione di un sistema ottico consiste nella capacità di distinguere due punti dell oggetto che stiamo osservando come due punti distinti fra di loro. L occhio umano ha un PdR = 0,1 mm Il microscopio ottico ha un PdR = 0,2 μm R = 0,61 λ / AN dove R = distanza minima fra due punti che il sistema ottico è in grado di risolvere, λ = lunghezza d onda del sistema di illuminazione impiegato, ed A N = apertura numerica dell obiettivo. AN = n senα dove n=indice di rifrazione del mezzo interposto fra lente ed oggetto; α = l angolo di accettazione della luce della lente frontale dell obiettivo

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5 Anatomia di un microscopio fotocamera o telecamera oculari stativo revolver con obiettivi tavolino traslatore vite macrometrica e micrometrica

6 IL MICROSCOPIO OTTICO Due lenti convergenti principali (in realtà sistemi ottici): obiettivo forma un immagine reale ingrandita dell oggetto oculare forma un immagine virtuale ulteriormente ingrandita

7 L obiettivo è rappresentato da un doppio sistema di lenti convergenti che proietta l immagine ingrandita ed invertita dell oggetto sotto osservazione all oculare in modo che questo possa "vederla" ed ingrandirla ulteriormente. La distanza della lente frontale dell obiettivo dal campione è piuttosto piccola variando da 30 mm a 0,1 mm a seconda del suo potere di ingrandimento, in maniera inversamente proporzionale: maggiore è il potere di ingrandimento minore è la distanza di lavoro dell obiettivo. Il revolver degli obiettivi è rotante e consta generalmente di 4 obiettivi ad ingrandimento crescente (4x, 10x, 40x e 100x). Col microscopio ottico si possono ottenere fino a 1000 ingrandimenti.

8 Il binoculare dà un ingrandimento di 10 volte (10x), ed è dotato di un dispositivo di allargamento-restringimento della distanza dei due oculari. L ingrandimento finale è dato dalla moltiplicazione dell ingrandimento dell obiettivo con quello dell oculare.

9 Anatomia di un microscopio fotocamera o telecamera fonte di illuminazione condensatore diaframma di campo

10 I campioni da esaminare al microscopio ottico devono essere illuminati perché si possa formare una loro immagine visibile nell oculare e, di solito, questo viene ottenuto con "luce trasmessa", ovvero la luce attraversa i campioni stessi. Il condensatore è un sistema di lenti posto al di sotto del tavolino traslatore del microscopio ed è provvisto di un "diaframma di apertura" che permette di modificare l ampiezza del cono di luce che da esso esce, adattandolo alla AN dell obiettivo in uso lente del condensatore focalizza la luce incidente sul campione diaframma regola l intensità luminosa La fonte di illuminazione è una radiazione con lunghezza d onda relativamente lunga (visibile nm)

11 Indagine Istologica Ematossilina-Eosina: l'ematossilina colora i nuclei di violablu, mentre l'eosina colora di rosa il citoplasma, il connettivo e le sostanze intercellulari.

12 La colorazione tricromica di Mallory viene fatta usando tre coloranti: la fucsina acida che tinge in rosso i nuclei l'azzurro di anilina che conferisce al connettivo collageno una tonalità azzurra l'orange G che colora i citoplasmi in arancione.

13 Indagine Istochimica Cerca di localizzare al microscopio ottico la presenza di determinate sostanze chimiche all interno della cellula. I componenti della cellula che si possono identificare sono: acidi nucleici proteine lipidi polisaccaridi

14 Reazione istochimica utilizzata per evidenziare il DNA: Reazione di Feulgen

15 Rosso Congo Sudan nero

16 Reazione istochimica utilizzata per evidenziare i carboidrati PAS I granuli di glicogeno presenti negli epatociti Lobo epatico

17 Reazione istochimica utilizzata per evidenziare le proteine in generale: Blu di Bromofenolo

18 IMMUNOISTOCHIMICA LA SEZIONE ISTOLOGICA VIENE FATTA REAGIRE DAPPRIMA CON L ANTICORPO CHE SI COMBINA DIRETTAMENTE CON IL SUO Ag (AbI) FORMANDO IL COMPLESSO PRIMARIO + = AbI Ag Complesso primarioag-abiabi SUCCESSIVAMENTE L ANTICORPO SECONDARIO MARCATO (AbII) VIENE INCUBATO SULLA SEZIONE CONTENENTE IL COMPLESSO PRIMARIO. L AbII SI COMBINA CON IL SUO ANTIGENE (AbI) RILEVANDONE LA LOCALIZZAZIONE + = Complesso secondario AbII Complesso primarioag-abiabi

19 Enzimi coniugati (perossidasi, fosfatasi alcalina, ß galattosidasi )

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21 Microscopio a fluorescenza La fluorescenza e` il fenomeno per cui alcune sostanze fluorescenti colpite da tale radiazioni emettono luce di λ maggiore e dunque visibili. Il preparato è legato a fluorocromi, molecole in grado di emettere luce di una specifica lunghezza d'onda (quindi di un unico colore) quando eccitati con luce di una lunghezza d'onda inferiore La sorgente luminosa e` una lampada a vapori di mercurio che emette radiazioni invisibili (ultravioletto, nm).

22 Fluorocromi ( isotiocianato di fluoresceina, rodamina, ficoeritrina )

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24 MICROSCOPIA ELETTRONICA Il microscopio elettronico utilizza un fascio di elettroni e non di fotoni, come un microscopio ottico, poiché i fotoni che compongono un raggio di luce posseggono un lunghezza d onda molto maggiore degli elettroni: dato che il potere di risoluzione di un microscopio è inversamente proporzionale alla lunghezza d onda della radiazione che utilizza, usando elettroni si raggiunge una risoluzione parecchi ordini di grandezza superiore.

25 Microscopio elettronico a trasmissione (TEM) 1931: Ruska & coll del gruppo del Prof. Max Knoll ottengono la prima foto al micr. Elettronico ( X) 1939: TEM disponibile sul mercato

26 Microscopio elettronico a scansione (SEM) Tra il 1935 e 1938: M. Knoll ottiene le prime immagini relative alla topografia della superficie di un campione colpito da un fascio di elettroni. Basi per la costruzione del primo Microscopio Elettronico a Scansione (SEM). 1938: in Germania, M. von Ardenne progetta il primo strumento 1965 il SEM diventa commercialmente disponibile

27 IL MICROSCOPIO ELETTRONICO A trasmissione (TEM): gli elettroni attraversano il preparato A scansione (SEM): gli elettroni incidono sulla materia, determinando l'emissione di elettroni secondari che, raccolti, forniscono immagini dettagliate della superficie degli oggetti dei quali risulta una visione tridimensionale.

28 TEM filamento (catodo) anodo condensatore preparato obiettivo proiettore schermo La sorgente luminosa è sostituita da un fascio di elettroni accelerati nel vuoto. Le lenti sono sostituite da campi magnetici ed elettrici che hanno un effetto convergente sugli elettroni. Gli elettroni si associano ad una lunghezza d'onda molto più piccola rispetto a quella dello spettro visibile; ciò determina un aumento del potere risolvente fino a circa 10 Å. L'immagine fornita è invisibile all'occhio umano, ma può essere fotografata e raccolta su uno schermo fluorescente che emette luce visibile sotto l'urto degli elettroni provenienti dal preparato; essa risulta in bianco e nero con varie tonalità di grigio in corrispondenza della maggiore o minore trasparenza agli elettroni delle strutture cellulari.

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30 Esempio di microfotografia elettronica al T.E.M.

31 S.E.M Ingrandimento : da 10 a volte Potere di risoluzione: 200 Angstrom Un fascio di elettroni primari, focalizzato da lenti elettroniche, viene inviato sul campione muovendolo, con un sistema generatore di scansione, così da farlo scorrere sulla superficie dell'oggetto in esame. Il fascio di elettroni durante la scansione del campione colpisce la sua superficie generando degli elettroni secondari. La quantità e l'energia degli elettroni secondari retrodiffusi da ogni punto del campione colpito dal fascio elettronico dipendono dalla morfologia, oltre che dalla natura chimica, del campione in quel punto. Un rivelatore di elettroni secondari retrodiffusi provvede a raccogliere il segnale che viene acquisito da un sistema di generazione dell'immagine ed inviato su uno schermo, ove viene così tracciata l'immagine del campione esaminato.

32 Esempio di microfotografia elettronica al S.E.M.

33 Fasi principali della preparazione di campioni per la Microscopia Elettronica a Trasmissione 1) Prelievo Il campione ottimale deve avere le minime dimensioni richieste per attuare un adeguata fissazione, disidratazione ed inclusione in resina

34 2) Fissazione Ha lo scopo di immobilizzare tutti i componenti molecolari e macromolecolari dell architettura cellulare, provocando l arresto istantaneo di tutte le attività chimico-fisiche cellulari Fissativo di Karnovsky: paraformaldeide 8%, gluteraldeide 50%, tampone fosfato 0.1M I fissativi sono veicolati da un opportuno tampone. Principali tamponi: a) Tampone fosfato (+ usato); b) Tampone cacodilato (sodio metil arsenato); c) Tampone veronal-acetato (altamente tossico) 2a) Post-Fissazione in Tetrossido di Osmio

35 3) Disidratazione Ha lo scopo di allontanare completamente i fluidi presenti nel campione, per poterlo poi sottoporre ai procedimenti di inclusione Passaggi: Etanolo 50% 10min 70% 10min 85% 10min 90% 10min 95% 10min 100% 2x20min

36 4) Trattamento con ossido di propilene ed Inclusione in resina Epon 812 La resina fornisce il sostegno necessario per tagliare il campione in fettine sottili. Si effettua una serie di passaggi in una miscela di ossido di propilene e resina epossidica per favorire la successiva impregnazione nella resina assoluta. Il trattamento in stufa a 60 C per almeno due giorni consente la polimerizzazione della resina.

37 5) Taglio con ultramicrotomo

38 6) Contrasto delle sezioni ultrasottili Sezioni ultrasottili 60-80nm vengono tagliate con lame di diamante e poste su retini. In seguito vengono contrastate con acetato di uranile e citrato di piombo e osservate al microscopio elettronico. Le sezioni di tessuto devono essere sottilissime per consentire il passaggio degli elettroni il cui potere di penetrazione è molto basso.

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