Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica

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Simone Alessandro Renzi
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1 Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica

2 Il microscopio ottico ed elettronico (T.E.M) OCULARE CANNONE ELETTRONICO OBBIETTIVI TAVOLINO PORTA CAMPIONE CONDENSATORE CONDENSATORE OBBIETTIVO PORTA CAMPIONE DIAFRAMMA DI CAMPO LAMPADA SCHERMO FLUORESCENTE CAMERA FOTOGRAFICA

3 Aumentando Occhio umano la risoluzione aumentano proporzionalmente Microscopio ottico anche gli artefatti e Microscopio elettronico a scansione la loro visibilità Microscopio elettronico a trasmissione

4 Problematiche la luce del microscopio ed il fascio di elettroni possono attraversare solo materiale di spessore molto ridotto il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchi, detti microtomi ed utramicrotomi la maggioranza dei tessuti biologici sono molli prima del taglio, il tessuto deve essere indurito Fissazione Inclusione Congelamento i tessuti sono normalmente quasi incolori e privi di contrasto prima dell osservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato o contrastato coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica

5 Fasi della preparazione Prelievo Fissazione Disidratazione Inclusione Taglio Colorazione

6 Prelievo Il prelievo è l operazione fisica con la quale si ottiene il campione da esaminare Deve essere eseguito da materiale biologico vivente Deve essere eseguito il più velocemente possibile Riduzione 10x10x3 mm per la microscopia ottica Spessore 2 mm per la microscopia elettronica

7 La Fissazione Ha lo scopo di bloccare i processi di degenerazione del tessuto prelevato rendendolo stabile nel tempo ed inalterabile all azione dei successivi trattamenti Mantiene inalterate le caratteristiche strutturali del campione, preservandone la morfologia Protegge il campione da danni osmotici (swelling e shrinking) FISICA CHIMICA Esposizione del tessuto a T molto alte o molto basse: Congelamento in N 2 o -30 C Calore (fiamma viva per materiale biologico strisciato su vetrino Uso di sostanze chimiche: Perfusione Immersione Con vapori

8 LE ALDEIDI FORMALDEIDE usata in soluzione (4-10%) in tampone ph 7.4 elevato potere di penetrazione ( 0.8 mm/h) agisce formando legami crociati con gli aa delle proteine (reversibili) preserva una buona morfologia PARAFORMALDEIDE preserva la reattività delle macromolecole indicata per indagini biochimiche La fissazione chimica Microscopia Ottica Formaldeide 4-10% + Saccarosio 2% in PBS ph ore 4 C PFA 10% + Saccarosio 2% in PBS ph ore 4 C

9 LE ALDEIDI GLUTARALDEIDE penetra bene nei tessuti, ma meno rapidamente della formaldeide forma cross-legami più velocemente e più stabilmente della formaldeide non fissa i lipidi, quindi per preservare le membrane La fissazione chimica Microscopia Elettronica GA 2-4% in Tampone Fosfato ph ore 4 C Post-fissazione con Osmio Tetrossido Fissa i lipidi insaturi agisce rapidamene, ma penetra molto poco Fissativo 2 reagisce in modo differente con i vari componenti cellulari accentuando le differenze di densità e fornendo una sorta di colorazione OsO 4 1-2% In Tampone Fosfato ph ore 4 C buio

10 I Tamponi I fissativi devono essere diluiti in tamponi a ph in modo che non ci sia diversità di ph fra il tessuto e la soluzione fissativa e per evitare artefatti dovuti a differenze di osmolarità Gli stessi tamponi utilizzati per diluire i fissativi devono essere impiegati per effettuare i lavaggi che seguono la fissazione (1-2 ore) PBS Tampone fosfato di Sorensen Fosfato bisodico 0.2M + Fosfato monosodico 0.2M Tampone Cacodilato Cacodilato di Na 0.24M + HCl 0.2M Più stabile nel tempo, ma contiene arsenico che è tossico

11 La Disidratazione E il passaggio che permette la sostituzione dell acqua contenuta nel tessuto con un solvente dei mezzi di inclusione (Paraffina o resine) La disidratazione si effettua mediane passaggi del campione in soluzioni di alcool in una scala crescente di concentrazioni Alcool 70% Alcool 90% Alcool 100% Chiarificazione Fissazione 3 con Acetato di Uranile in alcool 70% (T.E.M.) L ultimo agente deve essere miscibile con i mezzi di inclusione Xilolo Paraffina Acetone assoluto Ossido di propilene Resine idrofobiche per T.E.M. Infiltrazione Dopo aver concluso la disidratazione del campione bisogna sostituire gradualmente lo xilolo o l acetone con il mezzo di inclusione in forma liquida (Xilolo/acetone:mezzo di inclusione) 3:1 2: :2 1:3

12 Inclusione E il passaggio che permette di impregnare il campione in un materiale abbastanza duro ed omogeneo tale da poter essere tagliato in fette molto sottili PARAFFINA (M.O.) Miscela di idrocarburi saturi solida a T ambiente punto di fusione a insolubile in H 2 O, solubile in xilolo RESINE (T.E.M.) Epon, Araldite liquida a T ambiente polimerizza a C insolubile in H 2 O, solubile in acetone si preparano a partire da soluzioni di monomeri, da sostanze plasticizzanti che migliorano la consistenza finale del polimero e da un acceleratore chimico per la reazione di polimerizzazione Il campione viene immerso in paraffina o resina pura per completarne l infiltrazione

13 Polimerizzazione Paraffina (m.o.) Resina (T.E.M) T ambiente 4 C C Blocchetti pronti per essere tagliati in sezioni

14 Il taglio delle sezioni MICROTOMO Strumento che permette di sezionare i blocchetti di paraffina contenenti il campione in fette spesse 3-10 um

15 La raccolta delle sezioni Vetrini Xilanizzati La colorazione I coloranti sono di solito in soluzione acquosa. Le sezioni devono essere sparaffinate in xilolo e reidratate con scala decrescente di alcool (100, 90, 80, 70, 50,H 2 O) Metodica ematossilina eosina Ematossilina 10 min Lavaggio con H 2 O corrente Eosina 1 min Disidratazione Montaggio

16 COLORANTI PER MICROSCOPIA OTTICA I tessuti assumono i coloranti in base alle caratteristiche delle strutture che li compongono ACIDI BASICI NEUTRI carica negativa formano sali con basi colorano citoplasma carica positiva formano sali con acidi colorano i nuclei formati dall unione di un colorante acido con uno basico NATURALI animali : es. carminio (colorante acido nucleare) vegetali: es. ematossilina (colorante acido) ARTIFICIALI eosina (colorante basico citoplasmatico) fucsina, violetto di genziana (coloranti nucleari)

17 Materiale vegetale incluso in gel e tagliato con microtomo a vibrazione

COLORAZIONI chimiche: reazione tra colorante e substrato evidenziano molecole come lipidi e zuccheri OLIO ROSSO O O.R.O (PER LIPIDI) o.r.o. sciolto in soluzione di alcool etilico ed etere alcool etilico ed etere estraggono dalle cellule i lipidi o.

19 COLORAZIONI chimiche: reazione tra colorante e substrato evidenziano molecole come lipidi e zuccheri OLIO ROSSO O O.R.O (PER LIPIDI) o.r.o. sciolto in soluzione di alcool etilico ed etere alcool etilico ed etere estraggono dalle cellule i lipidi o.r.o si deposita al loro posto chimiche fisiche chimico fisiche COLORAZIONI ISTOCHIMICHE P.A.S. (PER ZUCCHERI) acido periodico di schiff ossida i gruppi CHOH-CHOH degli zuccheri CHOH-CHOH CHO-CHO reagisce con composto fucsina-acido solforoso e da colorazione fucsia

20 FISICHE: precipitazione di metalli su strutture biologiche Es. impregnazione argentica Sali d argento + sostanza riducente liberazione di Ag metallico che si deposita sulle strutture biologiche argentofile (fibre nervose) CHIMICO-FISICHE : meccanismo di assorbimento elettrico substrato e colorante hanno cariche diverse e formano sali fra loro EOSINA EMATOSSILINA

21 ULTRAMICROTOMO Strumento usato per sezionare i blocchetti di resina in sezioni molto sottili SEMIFINI: sezioni di 1 um di spessore, la cui osservazione al m.o. permette di selezionare i campi utili destinati ell esame ultrastrutturale al T.E.M.

22 SEZIONI ULTRAFINI: sezioni di nm di spessore Il taglio delle sezioni Lama di diamante Raccolta delle sezioni retino

LA COLORAZIONE il contrasto dipende dal numero atomico degli atomi del campione piu e alto il numero atomico, piu elettroni sono dispersi, maggiore e il contrasto le

23 LA COLORAZIONE il contrasto dipende dal numero atomico degli atomi del campione piu e alto il numero atomico, piu elettroni sono dispersi, maggiore e il contrasto le molecole biologiche sono costituite da atomi con numero atomico basso (H, C, O) le sezioni vengono contrastate con sali di metalli pesanti Acetato di Uranile e Citrato di Piombo

24 un esempio di applicazione semifini fini Sezione trasversale di una foglia Ultrastruttura di cellule a palizzata

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