COLORAZIONI ISTOMORFOLOGICHE

Transcript

1 COLORAZIONI ISTOMORFOLOGICHE

2 CLASSIFICAZIONE DELLE COLORAZIONI: Le colorazioni, indipendentemente dal meccanismo d azione del colorante, possono essere divise in due gruppi: 1.colorazioni istomorfologiche (nucleo, citoplasma, tessuto nervoso, collagene, ecc...); 2. colorazioni istochimiche (per mettere in evidenza le sostanze chimiche contenute nei tessuti e la loro posizione).

3 COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE): L ematossilina è una sostanza vegetale isolata da un estratto di legno azzurro (legno di campeggio, Haematoxylum campechianum ) un albero originario del centro America. Questa è di per sé incolore (o si presenta sotto forma di cristalli giallo-bruni) incapace di colorare. Il vero colorante non è l ematossilina, ma il suo prodotto di ossidazione: l emateina (per questo all ematossilina vanno aggiunte sostanze ossidanti come il permanganato di potassio, l idrato di potassio, iodato di sodio, ecc.). Ematossilina Emateina

4 COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE): L emateina è colorata e costituisce il cromoforo, è anionica e non ha particolari affinità con gli acidi nucleici. Per conferire al composto una carica positiva è necessario aggiungere un mordente (ad es. l allume potassico: KAl(SO 4)2 12H2O) che costituirà con l emateina, una lacca relativamente insolubile: l emallume. L ematossilina più usata nel laboratorio e quella di Mayer, ed e così costituita: -ALLUME DI POTASSIO; -EMATOSSILINA; -IODATO DI SODIO; -ACIDO CITRICO; -CLORALIO (tossico; corrosivo). Alcuni metodi di colorazione comportano una mordenzatura. Questa operazione consiste nel trattare il tessuto con un composto capace di fissare su di esso dei gruppi acidi o basici, i quali a loro volta, potranno legarsi con un colorante basico o acido. Il composto che costituisce questo termine di collegamento fra il tessuto e il colorante è detto mordente.

5 COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche) EMATEINA ossidazione di ematossilina Compl. con Al EMALLUME (Mayer - Carazzi) Fe EMAT. HARRIS (Lillie) progressive - Differenziazione regressive - ph Ematossiline

6 COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE): A seconda del mordente usato, alluminio, ferro, cromo, ecc..., si distinguono ematossiline alluminiche (o emallumi), ematossiline ferriche, ematossiline cromiche, ecc.... Le soluzioni ematossiliniche emalluminiche più usate in istologia sono: 1. Ematossilina di Mayer; 2. Ematossilina di Harris; 3. Ematossilina di Delafield; 4. Ematossilina di Carazzi; 5. Ematossilina di Ehrlich. 1. Ematossilina di Weigert; 2. Ematossilina di Heidenhain.

7 COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE): L eosina è un colorante artificiale debolmente acido, di cui esistono varie forme, che colora i citoplasmi, il tessuto connettivo e la sostanza intercellulare in varie tonalità di rosa. L'eosina è chimicamente una tetrabromofluoresceina. Più precisamente, sono di comune utilizzo due molecole di eosina denominate Y e B. Eosina Y Eosina B

8 COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE): sezioni in H2O distillata Emallume acido di Mayer, filtrato ( 7 ) lavare H2O corrente (10 ) Eosina [0.25 %], acidificata con qualche Risultati: goccia di CH3COOH (1 ) Nucleo Blu - viola lavare in H2O distillata (2 ) Citoplasma Rosa - rosso disidratare in etanolo 95 (4 ) disidratare in etanolo 100 (4 ) (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d inclusione (Entellan o balsamo Canada)

9

10

11

12

13

14

15

16 EMATOSSILINA DI EHRLICH

17 METODI CITOLOGICI La colorazione EE può essere descritta come un metodo che si utilizza per lo studio topografico e generale per tessuti e organi. Ci sono però alcuni metodi in grado di mettere in evidenza strutture specifiche: ci sono quindi metodi che evidenzieranno il connettivo piuttosto che il tessuto nervoso, ma anche tecniche per lo studio fine di organuli cellulari.

18 METODI CITOLOGICI CON COLORAZIONE REGRESSIVA DI LACCHE DI EMATOSSILINA Si tratta di metodi di cui non si conosce ancora appieno il meccanismo di azione. EMATOSSILINA FERRICA (Metodo di Heidenhain) Metodo di elezione per lo studio della cariocinesi. Regolando la differenziazione si possono mettere in evidenza anche i centrioli o inclusioni citoplasmatiche.

19 EMATOSSILINA FERRICA

20 STUDIO DEI TESSUTI E DEGLI ORGANI

21 TESSUTO NERVOSO

22 TESSUTO NERVOSO Tra le prime tecniche per lo studio del tessuto nervoso vanno ricordate quelle per mettere in evidenza i Corpi di Nissl. Uno di questi metodi prevede l uso del Cresyl Violet. Si tratta di un colorante basico che lega rapidamente le componenti acide del citoplasma dei neuroni (soprattutto l RNA dei ribosomi, compresi i nuclei). Questo colorante mette ben in evidenza i Corpi di Nissl che sono appunto aggregazioni del RER tipiche dei neuroni. Risultati: RNA nero Altre strutture viola Altri metodi impiegano l uso del Blu di Toluidina.

23

24 Metodo di GOLGI-CAJAL Per quanto riguarda lo studio della forma dei neuroni si possono usare alcuni metodi colorimetrici sia vitali che non (un esempio di colorazione vitale usata nei vertebrati è quella con il Blu di Metilene). Risultati migliori si ottengono mediante impregnazioni metalliche elettive. Fra questi metodi il più noto è quello dell impregnazione cromoargentica di Golgi (sec. Cajal) che utilizza la precipitazione elettiva di cromato di argento sulle cellule nervose quando queste sono state preventivamente fissate con tetraossido di osmio e bicromato di potassio. Oltre l argento si può usare anche l oro.

25

26

27 Metodo di BIELSCHOWSKY per neurofibrille Metodo di elezione per la visualizzazione di neurofibrille, assoni, dendriti, placca senile. I metodi di impregnazione argentica sono fra i metodi più comunemente usati in neuroistologia. Il principio su cui si basano le tecniche di impregnazione è il seguente: l argento, presente in alcuni composti allo stato di ossidazione +1 (es. AgNO3), può essere ridotto da alcune componenti tissutali allo stato metallico insolubile. Selettività del metodo Bielschowsky: il diverso grado di argirofilia degli elementi cellulari presenti del tessuto nervoso permette attraverso una opportuna calibrazione della soluzione riducente di evidenziare selettivamente neurofibrille, assoni, dendriti, placca senile.

28

29 TESSUTO NERVOSO (Luxol Fast Blue) Tale colora colorazione, sebbene in modo poco specifica per i fosfolipidi, li soddisfacente, specie se disciolti in alcool isopropilico e quindi fornisce ottima colorazione della mielina integra (costituita dalla membrana cellulare della cellula di Schwann). Tale colorazione è spesso associata al Cresyl Violet (Metodo di Klüver-Barrera). Risultati: Mielina blu-azzurro Luxol Fast Blue: Rame ftalocianina solfonata (X=SO3-)

30

31

32 Klüver-Barrera

33 TESSUTO CONNETTIVO

34 AZAN-MALLORY (AM) Colorazione AZAN (acronimo di AZocarmine-ANilin blue) modificata da Mallory. E una delle tecniche di colorazione utilizzate per mettere in evidenza le fibre collagene del tessuto connettivo. Il metodo associa una colorazione citologica ottenuta tramite un colorante acido (azocarminio) ad una colorazione di contrasto effettuata con blu di anilina dopo mordenzatura con acido fosfotungstico. Per ottenere buoni risultati occorre sovracolorare con azocarminio, quindi differenziare lentamente con alcol-anilina, al fine di evitare che la colorazione di contrasto predomini Blu di anilina Azocarminio

35 AZAN-MALLORY (AM) Si utilizzano in sequenza due coloranti: -Azocarminio (colora i nuclei in rosso vivo ed il citoplasma in rosso chiaro) -Miscela di Mallory (Blu d anilina, Orange G e acido ossalico, evidenzia il connettivo in azzurro). Risultati: Collagene, reticolo, granuli basofili (ipofisi) blu-azzurro Neurofibrille rossastro Muscolo arancio Nuclei, eritrociti e granuli acidofili (ipofisi) rosso Granuli citoplasmatici delle cellule delta dell ipofisi azzurro Il meccanismo di colorazione non è ancora completamente compreso. Alcune spiegazioni propongono che l'acido fosfotungstico funga da mordente per legare i colori basici al tessuto.

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45 COLORAZIONE MAY-GRÜNWALD-GIEMSA (MGG):

46 COLORAZIONE MAY-GRÜNWALD-GIEMSA: È una doppia colorazione utilizzata normalmente per colorare gli strisci di sangue (simile al metodo Wright-Giemsa). Il sangue viene strisciato su un vetrino portaoggetto, fissato per almeno 30 min. all aria e colorato prima con la miscela di May-Grüwald (blu di metilene, colorante basico, e eosina, colorante acido). Segue poi un lavaggio e una colorazione con l eosinato azzurro (colorante di Giemsa) composto da eosina giallastra, blu di metilene, azzurro A e B e violetto di metilene. Risultati: Globuli rossi rosa-arancio Nuclei dei leucociti blu-porpora Granuli eosinofili rosso brillante Granuli basofili blu Blu di metilene

47 Acidofilo Neutrofilo Piastrine Linfocita Basofilo Monocita

48

49

50

51 VERHOEFF VAN GIESON (VVG) Si tratta di un metodo combinato. Il metodo di Verhoeff è una colorazione specifica per le fibre elastiche (in particolare per la proteina elastina). La colorazione di Van Gieson è specifica per il collagene. In questo metodo le sezioni sono colorate regressivamente con ematossilina (usando un eccesso di mordente, il cloruro ferrico, in modo da avere una maggiore affinità della stessa ematossilina ferrica per le fibre elastiche rispetto agli altri elementi). Risultati: Fibre elastiche blu-nero Collagene rosso Nuclei blu-nero Altri elementi giallo

52

53

54 WEIGERT - VAN GIESON (WvG): Metodo combinato per la visualizzazione sul medesimo preparato delle fibre elastiche, del connettivo, del collagene e dei nuclei. Il metodo (Weigert metodo lungo ) sfrutta l affinità per le fibre elastiche del precipitato (cresofucsina) ottenuto facendo reagire resorcina, fucsina basica e cristalvioletto con perclorato di ferro. La specificità del metodo non è assoluta, altre strutture quali collagene e membrane basali possono colorarsi; è quindi importante una accurata differenziazione per ottenere una colorazione marcata e selettiva delle fibre elastiche. Il contrasto con la colorazione tricromica di Van Gieson permette di differenziare il collagene dal connettivo visualizzando nel contempo anche i nuclei. Applicazione : fibre elastiche.

55 Weigert - Van Gieson: Resorcina Fucsina basica Risultati Fibre elastiche da blu scuro a nero Nuclei neri Collagene rosso, Connettivo, eritrociti, ecc giallo Cristalvioletto

56

57 TRICROMICA DI GOLDNER: Una colorazione è detta tricromica quando si usano due o più coloranti per tingere differenzialmente diverse strutture istologiche. Il metodo della tricromica di Goldner (conosciuto anche come MassonGoldner) utilizza l ematossilina, rosso Ponçeau, orange G e light green. Risultati: Strutture basofile (come la cromatina) marrone-nero Strutture debolmente acidofile (cartilagine) rosso-arancio Strutture fortemente acidofile (fibre collagene, osso) azzurro-verde Rosso Ponceau Orange G Light green

58

59

60 TRICROMICA DI MASSON: Metodo di elezione per il tessuto connettivo, particolarmente indicato per gameti, nuclei, neurofibrille, nevroglia, collagene, cheratina, fibrille intracellulari e immagini in negativo dell apparato di Golgi. Il metodo associa una colorazione nucleare ottenuta con ematossilina ferrica di Weigert, una colorazione delle emazie con acido picrico e una colorazione del connettivo con due differenti coloranti acidi (Light Green oppure blu di anilina/blu di metilene) Risultati : Nuclei e gameti nero Citoplasma, cheratina, fibre muscolari, granuli acidofili rosso Collagene, muco, granuli basofili dell ipofisi blu /verde Eritrociti giallo

61

62

63

64

65

66 PENTACROMICA DI MOVAT: Questo metodo, piuttosto lungo e laborioso, consente di rivelare contemporaneamente le mucosostanze acide e i diversi componenti del connettivo. Coloranti utilizzati: alcian blu, resorcifucsina, blu di celestina sec Culling, ematossilina di Weigert e miscela di Van Gieson. Risultati: Mucine acide e sostanza fondamentale blu Collagene rosso Elastina rosso purpureo Muscolo giallo Neclei neri

67

68

69 Tessuto osseo Per l osservazione microscopica del tessuto osseo si utilizzano tecniche particolari che tengono conto della struttura dura e mineralizzata dell osso stesso. Per allestire un preparato sottile di tessuto osseo per l osservazione microscopica vengono generalmente impiegate delle varianti delle procedure tradizionali che possono essere schematizzate come segue: 1) METODI PER DECALCIFICAZIONE 2) METODI PER USURA

70 Osso Metodo per decalcificazione I metodi per decalcificazione servono per mantenere la componente organica dell osso, a scapito tuttavia della componente minerale che viene più o meno completamente rimossa. Il frammento di osso da esaminare viene fissato subito dopo il prelievo, al fine di preservare al meglio la morfologia delle cellule e l integrità delle molecole organiche della sostanza intercellulare. Successivamente si procede alla rimozione della componente minerale, che viene dissolta chimicamente mediante il soggiorno del frammento in una soluzione acida. Per queste tecniche si possono usare o soluzioni di acidi organici (es. acido citrico, acido ascorbico) o di chelanti del calcio (es. acido etilendiamminotetraacetico o EDTA, acido etilenglicoltetraacetico o EGTA), che rimuovono la parte inorganica senza troppo danneggiare la parte organica. Una volta rimosso il minerale, il campione viene trattato come qualunque altro campione molle: inclusione in paraffina, sezionamento con microtomo e colorazione.

71

72 Osso Metodo per usura I metodi per usura sono utilizzati quando si vuole preservare la componente minerale (ma anche la componente organica collagene mineralizzata). La componente cellulare (componente organica non mineralizzata) viene eliminata facendo macerare in acqua (per un tempo sufficiente) il frammento osseo prelevato. Successivamente dal frammento macerato viene tagliata manualmente una sezione piuttosto spessa che viene fatta asciugare e poi aderire ad un vetrino portaoggetto tramite una goccia di mezzo di montaggio (es. balsamo del Canadà o balsami sintetici). Una volta che questo si è solidificato, la sezione di osso viene lavorata con carta abrasiva a grana decrescente, fino a ridurla per usura ad uno spessore sufficientemente sottile da renderla attraversabile dalla luce. Viene poi messo sopra il montante e il vetrino coprioggetto.

73